Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén exakt kópiáit kell előállítani. Ezt hívjuk „molekuláris klónozásnak”. A gént tartalmazó DNS-t izolálni kell a genomból. Ez lehet egyszerű – de komoly problémák adódhatnak Molekuláris klónozás és biotechnológia yfg (your favorite gene)

A molekuláris klónozás alapjai Az alábbiak ismeretét feltételezem 1.Molekuláris biológia alapjai 2.Polimeráz láncreakció ( PCR=polymerase chain reaction ) 3.DNS szekvenálás

Minden gén ugyanolyan molekulákból épül fel, amelyek kémiailag homogének (DNS = A+C+G+T). Az örökítő anyag nagyon nagy. E. coli >1000 gén (4,600,000 bp) Ember – több mint 10,000 gén (kb. 4,400,000,000 bp) Egy adott gén a genomnak csak picike része. Az E. coli-ban egy-egy gén kb. a genom 0,05 %-a Emberben kb. 0,00005%-a Egy adott gén megkeresése nem ahhoz hasonlít, amikor egy tűt kell megkeresni a szénakazalban, hanem sokkal inkább egy bizonyos fűszálat kell megkeresni a szénakazalban! Ebben az esetben a szénakazal nagyon egyformának tűnik és csak akkor tudjuk megmondani a különbséget, ha minden egyes darabot megvizsgálunk. Mi a gond egy gén izolálásával?

Restrikciós enzimek - baktériumokból – a baktérium genom integritását védő egyik rendszer részei. Például: EcoRI –E. coli-ból Hat bázispárnyi felismerő hely, ezen belül vág – a megfelelő metiláz (EcoMI) a központi bazispárt metilezi, így védi saját DNS-ét a hasítástól. A tisztított enzim in vitro használható eszköz. A DNS-t bármelyik GAATTC szekvenciánál elvághatja - minden genomra jellemző a GAATTC szekvenciák száma és elhelyezkedése és mindig ugyanott vannak. (statisztika) A genom darabolása kezelhető méretű részekre

A plazmid klónozó vektor tulajdonságai 1.kicsi 2.A gazdában stabil 3.Nagy kópiaszám 4.Könnyű tisztítani 5.Be tud fogadni idegen DNS-t 6.Egyszeres „klónozó” helyek 7.Szelektálható marker – antibiotikum rezisztencia 8.A gazdába könnyen bejuttatható (transzformáció, transzdukció) Hogyan tudjuk stabilan fenntartani és szaporítani az idegen DNS darabot? – beültetjük egy stabil replikonba pBR322

pBR322, felnyitva az egyszeres EcoRI helynél EcoRI idegen DNS EcoRI DNS ligáz+ATP Rekombináns DNS NNNGAATT NNNC EcoRI vég az inzerten CKKK TTAAGKKK EcoRI vég a vektoron „ragadós” végek NNNGAATTCKKK NNNCTTAAGKKK Fúziós hely új EcoRI hely Különböző DNS darabok egyszerű fúziója

 komplementáció LacZ + - kék telep LacZ - - fehér telep -ha megszakítjuk a lacZ gént, a telep fehér  komplementáió – a  -galaktozidáz enzim modul rendszerű felépítésén alapul - klónozó vektoroknál gyakran alkalmazott alapvető technika – inzerciós inaktíválás

Hogyan működik az  -komplementáió? A  -galaktozidáz tulajdonságaira vezethető vissza Néhány E. coli törzs termeli a  -Gal  fragmensét Ha az  fragmenst transz (plazmidról) termeltetjük működik a  -Gal

Génkönyvtár – az inzert DNS nagysága Minél nagyobb a fragmentum, a genomnak annál nagyobb része lesz egy plazmidban Génkönyvtár készítésekor kiszámíthatjuk a teljes genomot reprezentáló egyedi rekombináns DNS molekulák számát. N = [ln (1-P)]/[ln (1-f)] P – a teljes lefedettség valószínűsége N – a szükséges egyedi klónok száma f – a genom részaránya az átlagos fragmentum méretben N = [ln.01]/[ln ] = -4.6/-1.14 x = 40,350,877 egyedi plazmid klón A humán genomra és egy átlagos plazmidra P – 99%, vagy 0.99 konfidenia f – 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x A plazmid vektorok átlagosan 5 kb-nyi Inzertet viselnek el stabilan.

Nagyobb inzertek mint a plazmidokban – bevitel fágfertőzéssel 20 – 35 kb inzertek A bakteriofág/cosmid vektorok nagyobb inzertet képesek befogadni N = [ln.01]/[ln ] = -4.6/-7.95 x = 578, 616 egyedi klón Humán genom és standard fágvektor P – 99%, vagy 0.99 konfidencia f – 35 kb/4,400,000 kb = 7.95 x Nagy előrelépés!

Átlagosan 300 – 500 kb inzert DNS – nagy genomokhoz remek Élesztő mesterséges kromoszóma (YAC) és baktérium mesterséges kromoszóma (BAC) N = [ln.01]/[ln ] = -4.6/-1.14 x = 40,350 egyedi klón Humán genom és standard YAC P – 99%, vagy 0.99 konfidencia f – 500 kb/4,400,000 kb = 1.14 x !!!!!!!!!!

Mi a YAC? (yeast artificial chromsome) élesztő mesterséges kromoszóma Élesztőben önállóan replikálódó vektor. Nagy inzertek befogadására képes.

Mi a BAC? (bacterial artificial chromsome) baktérium mesterséges kromoszóma - nagyon kis kópiaszám, nagy méretű inzert kapacitás Az E. coli F plazmidjából - Stabil öröklődés kópia/sejt (szigorú kópiaszám szabályozás)

Kész BAC könyvtárak

Szabályozott expressziós rendszerek – sok változat Többrészes repressziós hurok Transzkripciós aktívátorok I. osztálya araC-P BAD kazetta 1. Szoros represszió arabinóz nélkül (és glükózzal) 2. Nagy mértékű aktíválás arabinózzal

Különösen szigorú szabályozás és nagyon nagy expresszió

Génfúziós rendszerek – egy gén aktivitásának vizsgálata egy másik génnel fúzionáltatva RIPORTER GÉNEK HeLa sejtekben gfp és rfp megnyilvánulás A legújabb kedvencek az autofluoreszcens fehérjék.

A bakteriális transzpozonok alkalmazása – Tn5

Mutagenezis baktériumokban A transzposzóma Templátok szekvenáláshoz

Az RNS polimeráz aktiválását segítő faktorok meghatározása – Y2H; B2H rendszerek

Élesztő kéthibrid (Y2H) és baktérium kéthibrid rendszerek (B2H) fehérje-fehérje kölcsönhatások meghatározása Egy B2H