Génterápia A páciens sejtjeinek genetikai módosításán alapuló terápia. - klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <--- szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert. - nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása, a mutáció “kijavítása“ Csak szomatikus génterápia végezhető!

(27) (86)

Genetic diseases: Type 1: Egy defektív lokusz (gene), mely a betegség okozója, 100% örökletes. példa: Sickle cell anemia, Hypercholesterolemia Cystic fibrosis Type 2: Több génes, <100% örökletes, és a betegség megjelenését a környezet és az életstílus befolyásolja. példa :Heart disease Cancer Diabetes Alcoholism Schizophrenia Criminal behavior? etc….?

A génterápiát befolyásoló tényezők optimális kedvezőtlen Öröklődés módja recesszív domináns Mutáció funkció hiány túltermelés Tárgysejtek könnyű rossz (agy). elérhetősége ex vivó in vivó esetleg elérhetősége ex vivó in vivó esetleg A DNS mérete kicsi óriás A génexpresszió kevéssé szigorú kontrol szabályozása szabályozott szabályozása szabályozott

- klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: <--- így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <--- szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert.

- klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô: így pótoljuk a hiányzó aktivitást, szelektíven megöljük a target sejtet, mozgósítjuk az immun-rendszert.

- nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása, a mutáció “kijavítása“

Ex vivó Génterápia

Gattinoni, et al, Nature Reviews in Immunology 6:383 (2006) Dramatic regression of metastatic melanoma sometimes results from adoptive transfer of expanded TIL

In vivó terápiás génbevitel

Génterápia tumorok kezelésére Vírus vektor – TNF gén sugárzás érzékeny promoter

Az ideális vektor jellemzői: 1.Csak a célsejtbe jusson be. 2.Nagy inzert, egy vagy több gén beépíthető. 3.Ne váltson ki immunválaszt. 4.Stabil legyen, ne mutáljon el. 5.Könnyű legyen nagy mennyiségben(titer) gyártani. 6. A hatáshoz elegendő mennyiségű fehérjét termeljen.

A leggyakrabban használt vektorok RetrovirusAdenovirus Adeno-Naked DNA/ associated Liposomes Insert size8kb~30kb4kbunlimited Integrationyesnorarerare Production>10 6 cfu/ml>10 11 >10 12 unlimited Administration ex vivoex/in vivoex/in vivo ex/in vivo Expressionlongtransientpot. good?Transient Express level moderatehighmoderatehigh Immunefewextensive??None Safety concerns:InsertionalInflammatoryInflammatorynone? mutagenesisresponse responsetoxic (25%) (3%)(25%) (*2006)

Génterápiában alkalmazott vektorok viselkedése

Retrovirus life cycle From: Alberts et al. Molecular Biology of the Cell

Retrovirus genome 5’ LTR Packaging Gene X Neo r 3’ LTR Encapsidation (packaging) Retrovirus vector construction for gene therapy

5’ LTR Packaging Gene X Neo r 3’ LTR Retrovirus vector packaging for gene therapy Packaging cell line express viral gag and pol Produce high titer recombinant virus in hours. Packaging cell line (makes virus) 1. + Vector (transfection) 2.Collect virus after hrs. 3.Concentrate virus / high titer. 4.Transduce host cell.

Nem virális DNS bejuttatás: 1.Cationic liposomes: Positively charged lipids interact with negatively charged DNA. (lipid-DNA complex). -Transverses cell membranes Advantages: a. Stable complex b. Can carry large sized DNA c. Can target to specific cells d. Does not induce immunological reactions. Disadvantages: a. Low transfection efficiency b. Transient expression c. Inhibited by serum d. Some cell toxicity

Génbevitel liposzóma segítségével

Nem virális DNS bejuttatás 2. Plasmid DNS injektálás cDNA Promoter + gene of interest (P) (gene X) P Gene X Megfigyelt expresszió tímusz, váz és szív izom, bőr.

Egy gén expressziójának csökkentése

- Decrease expression -Ribozyme aaaaa auucg ccguuua uaagc-- ggcaaau---- cDNA ribozyme Cleavage of the target mRNA

- Decrease expression -Antisense aaaaa caaucggccccuucguuua ---- gttagccggggaagcaaat 1- Small single-strand DNA oligonucleotides ( bases) RNAse degradation of the RNA/DNA double strand molecule

ADA/génterápia Ashanti de Silva: az elsô páciens, aki génterápiás kezelésben részesült (1990-ben). Adenosin dezamináz-hiány (ADA) a T-sejtek mûködési zavarát idézi elô -> immunhiány. Ex vivo génterápiával a T-lifocitákat ADA cDNS-t tartalmazó retrovirussal fertôzték, majd a páciensbe visszajuttatták. Párhuzamosan enzim-szubsztituciós terápiát is alkalmaztak.

A génterápia első áldozata Jesse Gelsinger (18 éves)

Case study: Jesse Gelsinger *First documented patient to die from gene therapy treatment. (may have been others). Disease: liver enzyme deficiency (ornithine transcarbamylase, OTC) – controls ammonia metabolism Vector used to deliver OTC – modified adenovirus Goal: deliver vector to liver cells and express OTC. Problem: Very low transfer efficiency (1%), difficult to get enough functioning OTC expressed to do any good. Solution: Infect with higher dose of viral particles. (38 trillion)

Outcome: - Vector not only delivered gene to liver but to other tissue. -Triggered systemic inflammatory response. -Patient acquired fever, coma, death. Why? -Animal studies suggested dose was OK (?). -Adenoviral vectors known to induce inflammatory response. -Patient already compromised: Patient had higher than allowed ammonia levels.

Results of follow-up investigation: -3 month investigation by FDA concluded. - patient enrollment in study despite ineligibility. - participants misled on safety and toxicity issues. - loosening of criteria for accepting volunteers. - informed consent document did not reveal results of animal studies. * Other investigators may not have disclosed important information on patient deaths in gene therapy trials. Adenovirus safety: Engineered to prevent viral replication. Mutation from replication incompetent to competent? Shut down of Univ. of Penn. Institute for Human Gene Therapy Lawsuits

Antitestek használata vizsgálati és terápiás célokra

Source: CDC Vaccines have dramatically reduced infectious disease incidence Mechanism: Vaccines stimulate specific antibody production, blocking infection at an early stage

Chimeric mAb

99m Tc-mAb in vitro in vivo Tumor diagnosis

Sharkey, RM and Goldenberg, DM CA Cancer J Clin. 56::226 (2006) Enhancing antibody cytotoxicity for cancer therapy

Scallon BJ, et al J Immunother 29:351 (2006) Oncology Antibodies approved by the US FDA

Epitopes Immune Response Antibodies A mixture of antibodies - all bind to epitopes of the original antigen. Some bind with higher affinity than others. Polyclonal antibodies Protein Immunize

Kuby Figure 4-22

Antibodies can be “humanized” to avoid host immune responses

Chimeric mAb

FÁG DISPLAY