A szabályozó fehérjék szabályozása

A Rac kis G fehérje szabályozása GAP Rac·GTP Rac·GDP GEF RhoGDI·Rac·GDP GAP = GTPáz aktiváló protein GEF = Guanin nukleotid kicserélő faktor GDI = Guanin nukleotid disszociáció inhibitor

A kis GTPázok alcsaládjai és szabályozó fehérjéi RAS RHO RAB ARF RAN H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- Ran K-Ras Rho-B Rab32 ARF7 N-Ras Rho-C Rap1 Rac1 Rap2 Rac2 Ral Cdc42 GAPok 25 70 52 27 1 GEFek 50-60 Rho-GDI Rab-GDI

Mi újság a GEF-ek körül?

A DH-GEFek domén szerkezete (Zheng, 2001)

GEF-ek GTPázok Target fehérjék

GEF-ek GTPázok Target fehérjék

GEF-ek GTPázok Target fehérjék

GEF-ek GTPázok Target fehérjék

PROBLÉMA: Hol a specificitás? GEF-ek GTPázok Target fehérjék PROBLÉMA: Hol a specificitás?

Specificitás pedig van: Patel et al. 2002, MBC, 13., 1215-1226

MEGOLDÁS: fehérje komplexek GEF-ek GTPázok Target fehérjék MEGOLDÁS: fehérje komplexek

1. példa RGS PH/DH p115RhoGEF

RGS PH/DH p115RhoGEF Rho

CNK1 target/scaffold fehérje RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje Jaffe A.B. et al. MCB 24. 1736. 2004; Cur. Biol. 15. 405. 2005;

RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MLK2 kináz

RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MLK2 kináz Jun → Jun-P

RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P

LPA-R Plazmamembrán Gα12 RGS PH/DH p115RhoGEF Rho CNK1 target/scaffold fehérje MKK7 MLK2 kináz Jun → Jun-P Kísérleti tény: CNK1 hiány: LPA-indukált jun-P hiányzik, de stressz-rost képzés változatlan CNK1 túltermelés: (GEF/Rho63 indukált) jun-P ↑ stressz-rost képzés ↓ (Rho megkötése)

2. példa Tiam-1 Rac Conolly BA et al., MCB 25. 4602. 2005.

2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin

2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin WAVE 2 p38 MAP kináz Aktin citoszkeleton p38 MAP kináz p70 S6 kináz

2. példa Tiam-1 Rac IBS/JIP2 IRSp53 siderophilin WAVE2 p38 MAP kináz Aktin citoszkeleton p38 MAP kináz p70 S6 kináz

Cdc42 IRSp53 Mena filopódium képzés

DH/PH Tiam-1 Rac Cdc42 IRSp53

DH/PH Tiam-1 Rac Cdc42 IRSp53

DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 lamellipodium képzés

PDGF-R Ras DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 lamellipodium képzés

PDGF-R Ras DH/PH Tiam-1 Rac IRSp53 WAVE2 Kísérleti tény: IRSp53 hiányban PDGF-R indukált lamellipódium képzés ↓ lamellipodium képzés

3. példa Cool-2/α-Pix (Cloned out of library 2) (PAK-interactive exchange factor) Feng et al., EMBO J. 23. 3492. 2004; Baird et al., Curr. Biol. 15. 1. 2005

Cool-2/α-Pix dimér mint Rac-GEF Cdc42 → Rac aktiválás mechanizmusa

Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF Gβγ + PAK kötődés

Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF Gβγ + PAK kötődés GEF-smg-target komplex

Gondolatok: G-fehérje kaszkádok Gα12 → p115RhoGEF → Rho Ras → Tiam-1 → Rac Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac 2. smg kezd „beágyazódni” (up-stream, down-stream kapcsolatok)

GAPok

Rho/Rac GAPok doménszerkezete TiCB 13. 13-22. 2001

Lipidek részvétele GAP-ok szabályozásában Chimaerin Rac PMA, DAG, stb. ↑ / ↓ ASAP1 ARF1, ARF5 PIP2 ↑ GIT ARF6 PIP3 ↑ ARAP1 ARF1, ARF5 PIP3 ↑ Rho = ARAP3 ARF6 PIP3 ↑ Brown et al. MCB 18. 7038. 1998; Vitale et al. JBC 275. 13910. 2000; Miura et al. Mol. Cell 9. 109. 2002; Krugmann et al. Mol. Cell 9. 95. 2002

A PL szerkezet hatása az ARF-GAP1 aktivitására Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848.

A vezikulaméret hatása az ArfGAP1 aktivitására Bigay J. et al. Nature 2003. 426. 563.

Az ARF-GAP1 szabályozásának modellje Bigay et al. Nature 2003. 426. 563

Az ARFGAP és ARFGEF lipid érzékenysége Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51

Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51

A p190RhoGAP domén szerkezete Src PKC GTPáz 4 x FF GAP

PS hatása az endogén GTPáz aktivitásra Rac Rho Ligeti et al. JBC 2004.

PS hatása p190 Rho-GAP és Rac-GAP aktivitására Bound 32P-GTP (%) Bound 32P-GTP (%) p190GAP relatív menyisége Ligeti et al. JBC 2004.

A kísérletek kontrollja [32P]GTP fogyás alapján [32P]foszfát keletkezés alapján Ligeti et al. JBC 2004.

PS és SDS hatása a p190 Rho- és RacGAP activitására Ligeti et al. JBC 2004.

Különböző PL-k hatása a p190 GAP activitására Rac Rho Ligeti et al. JBC 2004.

A PKC hatása a p190 Rho- and RacGAP activitására ATP jelen ATP nélkül

P190 kísérletek újdonsága: GAP fehérje módosítása változtatja a szubsztrát specificitást Hasonló helyzet: MgcRacGAP → nem-foszforilált állapotban Rac/Cdc42-GAP foszforiláció után: Rho-GAP is Minoshima et al. Dev. Cell 4. 549. 2003.

További példák GAP-szabályozásra Autoinhibició: p50GAP – nyitja: smg prenil csoportja RA-RhoGAP – nyitja: RapGTP kapcsolódás funkció: neurit növekedésben

GAP hatástól független funkciók: p190GAP FF-domén TFII-I köt, citoszolba lokalizálja azt FF-domén Tyr-foszforiláció → TFII-I elengedés → magba vándorol Tumbleweed (RacGAP50C) (Droso) axon növekedés – GAP hatás függő citokinesis – GAP hatástól független p50GAP Sec14 domén lokalizálja, Sec14 mutáció – de nem GAP domén mutáció – biológiai hatása

p50GAP eloszlása és biológiai hatása a Sec14 doménhoz kötött Sirokmány et al. 2006 JBC. 281. 6096.

Rho-GDI

RacGDP RhoGDI RhoGDP

RacGDP → RacGTP X P - RhoGDI RhoGDP PAK

X RacGDP → RacGTP P - RhoGDI RhoGDP PAK Cdc42 / Rac DerMardirossian C. et al. Mol. Cell 15. 117. 2004.

Gondolatok: G-fehérje kaszkádok Gα12 → p115RhoGEF → Rho Ras → Tiam-1 → Rac Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac Cdc42→ PAK → RhoGDI→ Rac Rap → RA-RhoGAP → Rho↓ 2. smg kezd „beágyazódni” (up-stream, down-stream kapcsolatok)

Bernards A. and Settleman J. IRODALOM Bernards A. GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila BBA 1603. 47-82. 2003. Bernards A. and Settleman J. GAP control: regulating the regulators of small GTPases Trends Cell Biol. 14. 377. 2004.