A ghrelin kardiovaszkuláris hatásainak vizsgálata Dr. Sax Balázs A molekulától a betegágyig, a sejttől a szervezetig PhD-kurzus, 2012.04.16.

Ghrelin a növekedési hormon elválasztását serkentő receptor (GHS-R) endogén ligandja 28 aminosav aktív formájá: Ser3 octanoil csoport (GOAT enzim) keringő ghrelin 90%-a dezacilált (inaktív?) elsősorban a gyomorban termelődik, de mRNS-e és receptora többféle szövetben megtalálható (pl. érendotél, szívizomszövet) két receptor-altípus létezik: GHS-R1a (GPCR 7 TM) GHS-R1b (GPCR 5 TM)

Ghrelin szöveti expresszió Legmagasabb kópiaszámban: Gyomor fundus Vékonybél Tüdő Pankreász Vese Vastagbél Hipothalamus Alacsonyabb kópiaszámban: Limfocita Szívizomszövet Ghrelin mRNS kópia szám ( Gnanapavan et al. 2002 )

GHS-R1a szöveti eloszlás GHS-R 1a mRNS kópiaszám Hipofízis Hasnyálmirigy Pajzsmirigy Lép Szívizomszövet ( Gnanapavan et al. 2002 )

GHS-R1b szöveti eloszlása GHS-R 1b mRNS kópiaszám GHS-R1b szöveti eloszlása Bőr Szívizomszövet Hipofízis Pajzsmirigy Hasnyálmirigy Vékonybél Vastagbél Máj Emlő Lép .... ( Gnanapavan et al. 2002 )

A ghrelin hatásai Központi idegrendszeri hatások Metabolikus hatások növekedési hormon elválasztásának serkentése táplálékfelvétel serkentése bélmotilitás fokozása (n. vagus) gyomorsav-termelés Metabolikus hatások zsírraktárak növelése negatív korreláció az inzulinszinttel és a BMI-vel Kardiovaszkuláris hatások www.phoenixpeptide.com Agy Hipofízis Étvágy Növekedés Kardio-vaszkuláris rendszer Metabolizmus Növekedési hormon Neuroendokrin sejt

Kardiovaszkuláris hatások: pertérfogatot és a verővolumen növelése pumpafunkció javítása krónikus szívelégtelenségben vérnyomás csökkentése (centrális és perifériás mechanizmus) kardioprotektív hatások: ischaemia-reperfúzióban csökkenti az infarktusméretet csökkenti az oxidatív stressz mértékét antiinflammatorikus hatás antiaritmiás hatás gátolja a szívizomsejtek apoptózisát serkenti az angiogenezist kétirányú érhatások

Vizsgálatok Szívizom ghrelintermelésének vizsgálata ischaemiás szívbetegségben Ghrelin direkt koronáriahatásának vizsgálata izolált kutya arteriolákon

Perikardiális folyadék ghrelintartalmának vizsgálata ischaemiás és non-ischaemiás szívbetegségben A ghrelin plazma és perikardiális koncentrációinak jellemzése iszkémiás (CABG) és nem iszkémiás (billentyűműtétre kerülő) betegcsoportokban. A ghrelinkoncentráció és egyes metabolikus és funkcionális kardiológiai paraméterek összefüggésének vizsgálata.

Perikardiális folyadék eredetét tekintve főként miokardiális transzszudátum több szíveredetű ágens a a plazmánál magasabb koncentrációban van jelen (pl. ET-1, ANP, adenin nukleozidok) ischaemiás szívbetegségben ezen anyagok koncentrációja (pl. adenin nukleozidok) tovább emelkedhet ezen magas lokális koncentrációban jelen lévő ágensek visszahathatnak a szívműködésre

Mintavétel és módszer intraoperatív perikardiális folyadék (PF) mintavétel és egyidejű centrális vénás vérvétel aktív (acilált) és összes (acilált + dezacilált) ghrelin meghatározás (RIA), inzulin mérés (ELISA), echokardiográfiás és egyéb laboratóriumi paraméterek BILL ISCH betegszám 41 54 férfi/nő 15/26 43/11* kor (év) 661 631 BMI (kg/m2) 26,90,7 28,20,5 Diabetes mellitus 4/37 18/36 * HOMA-A 2,50,2 2,90,4 EF (%) 621 551 * * p<0,05 BILL vs. ISCH

Aktív és összes ghrelin koncentráció a plazmában és perikardiális folyadékban magasabb perikardiális aktív ghrelin szint ischaemiás szívbetegségben perifériás ghrelin szintek között nincs különbség magasabb PF/plazma ghrelin arány az ISCH betegekben fokozott myocardialis ghrelin- termelés ISCH szívbetegségben * BILL vs. ISCH p<0,01 # PF vs. plazma p<0,01

Korreláció echokardiográfiás paraméterekkel Összes beteg (n=95) EF EDD ESD SWT PWT LVM RV TAPSE Plazma totál ghrelin R 0.050 -0.089 -0.082 -0.143 -0.243 -0.275 0.075 0.107 p 0.658 0.393 0.433 0.271 0.069 0.038 0.554 0.530 Perikardiális totál ghrelin -0.070 -0.022 0.029 -0.173 -0.354 -0.249 0.007 0.253 0.533 0.833 0.781 0.181 0.061 0.953 0.129 Plazma aktív ghrelin -0.048 0.000 -0.002 -0.133 -0.252 -0.119 0.160 0.198 0.999 0.984 0.307 0.060 0.381 0.205 0.239 Perikardiális aktív ghrelin -0.163 0.074 -0.097 -0.306 -0.146 0.053 -0.005 0.169 0.795 0.511 0.487 0.032 0.316 0.688 0.978 Perikardiális/ plazma totál ghrelin arány 0.161 -0.086 -0.108 0.153 0.240 0.046 0.090 -0.247 0.146 0.412 0.298 0.236 0.072 0.730 0.475 0.139 Perikardiális/ plazma aktív ghrelin arány 0.132 -0.121 -0.027 0.084 -0.018 0.102 0.177 0.267 0.840 0.281 0.844 0.562 0.897 0.440 0.322 A perikardiális ghrelin szint a septummal nem, csak a bal kamrai hátsó fallal mutat összefüggést, ami a szabad kamra fal ghrelintermelő szerepére utalhat. A bal kamrai izomtömeggel talált összefüggés hátterében vélhetőleg a BMI-vel mutatott negatív összefüggés áll.

Korreláció metabolikus paraméterekkel Összes beteg (n=95) Body mass index Össz-koleszterin Tri-glicerid Plazma glukóz Plazma inzulin HOMA-A index Plazma totál ghrelin R -0.223 0.054 0.145 -0.163 -0.288 -0.326 p 0.030 0.603 0.166 0.115 0.006 0.002 Perikardiális totál ghrelin 0.003 -0.091 0.185 -0.061 -0.371 -0.395 0.973 0.386 0.077 0.557 0.000 Plazma aktív ghrelin -0.159 -0.072 0.201 0.018 -0.192 0.128 0.496 0.057 0.865 0.071 Perikardiális aktív ghrelin -0.090 0.125 -0.006 -0.233 0.997 0.419 0.266 0.957 0.047 0.038 Perikardiális/ plazma totál ghrelin arány 0.192 -0.133 0.081 -0.157 0.061 0.205 0.442 0.073 0.067 0.135 Perikardiális/ plazma aktív ghrelin arány 0.037 -0.088 -0.064 -0.008 -0.045 -0.060 0.743 0.439 0.572 0.942 0.690 0.596 A plazma összghrelin negatív korrelációja a testtömegindexszel és az inzulinrezisztenciával az irodalomból ismert összefüggés. A perikardiális ghrelin szintek összefüggése a plazma inzulinszinttel és az inzulinrezisztenciával felveti a szénhidrátháztartás szabályozó szerepét a lokális ghrelintermelődésben.

Következtetések Az emelkedett perikardiális ghrelin szint a krónikusan ischaemiás myocardium fokozott ghrelintermelésére utal. Az echokardiográfiás és metabolikus paraméterekkel talált korrelációk a szabad kamrafal szerepére utalnak a perikardiális ghrelin termelődésében, valamint felvetik a széhidrát-háztartás szabályozó szerepét is. A ghrelin sokrétű kardioprotektív szerepét figyelembe véve az észlelt fokozott ghrelintermelődés a krónikusan iszkémiás szívizom önvédő mechnizmusának része lehet.

A ghrelin direkt érhatásának vizsgálata izolált kutya koronária arteriolákon

- patkány / izolált szív és izolált koronária arteriola Pemberton et al. 2004 5-10 nM endotelin-1 42 mM KCl humán / izolált mezenteriális artéria szuperfúzió Dimitrova 2007 10 nM endotelin-1 tengerimalac / vese artéria gyűrű szuperfúzió Dimitrova et al. 2006 malac / intrakoronáriás bolus Grossini et al. 2007 humán / arteria mammaria gyűrű szuperfúzió Kleinz et al. 2006 Wiley et al. 2002 humán / a. brachialis infúzió alkari véráramlás növekedés Okumura et al. 2002 patkány / iv. bolus - MAP esés Shinde et al. 2005 humán / iv. infúzió - MAP esés Nagaya et al. 2001 Prekontrakció Faj/modell Szerző ÉRÖSSZEHÚZÓDÁS ÉRTÁGULAT

Célkitűzések A ghrelin receptor altípusok (GHS-R1a, GHS-R1b) jelenlétének vizsgálata kutya koronária ereken. A ghrelin koronária arteriolákra kifejtett hatásának vizsgálata spontán és emelkedett értónus mellett. A GHS-R1a szerepének vizsgálata az érválasz létrejöttében.

A ghrelin receptorok vizsgálata immunhisztokémiával kutya koszorúereken primer antitest: nyúlban termelt humán GHS-R1a, GHS-R1b elleni antitestek detektálás: - biotinilált szekunder antitest - avidin-biotinperoxidáz komplex (ABC) - kromogénként diaminobenzidin (DAB) - háttérfestés hematoxylinnal 27kDa 35kDa 55kDa 70kDa 100kDa 130kDa 250kDa 15kDa GHS-R1a 44 kDa GHS-R1b 32 kDa pozitív kontroll: kutya hipotalamusz GHS-R1a, GHS-R1b pozitív sejtek negatív kontroll: elsődleges antitest elhagyása antitestek validálása Western blot technikával

GHS-R1a immunpozitivitás b c d e f g h i Kutya hipotalamusz Kutya hipotalamusz

GHS-R1b immunpozitivitás a b c d e f g h i Kutya hipotalamusz Kutya hipotalamusz

A ghrelin érhatásának vizsgálata izolált intramurális koronária arteriolákon Inkubáció: - normál Krebs- Ringer oldat (nKR) - pH 7,4; 37oC - buborékoltatás: 5%CO2, 20%O2, 75% N2 - 50 Hgmm-es intralumináris nyomás szervopumpákkal - endotél funkció (teszt: 10 µM Ach) Intramurális koronária arteriola izolálás, kanülálás egészséges kutyaszívből (belső átmérő: 210±16 µm) Átmérőváltozás mérése mikroangiometria

GHS-R1a receptor specifikus blokkolószere Protokoll 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR nKR 20 min A Tromboxán analóg n=8 1 mM U46619 B 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR nKR 1 mM U46619 1 mM U46619 + 50 mM D-Lys3-GHRP-6 20min GHS-R1a receptor specifikus blokkolószere n=8

Ghrelin hatása az érátmérőre izolált koronária arteriolákon * p<0,05, **p<0,01 normál tónus vs. U46619-prekontrakció (Student-féle egymintás t-próba), átlag±SEM

Ghrelin hatása az érátmérőre GHS-R1a receptorblokádban izolált koronária arteriolákon

Következtetések A GHS-R1a és GHS-R1b receptorok jelen vannak a kutya koronária arteriolák falában. A ghrelin kutya koronária arteriolákon megemelt tónus esetén érszűkítő hatással bír. Bár a receptor jelen van az érfalban, a vazokonstriktor válasz nem a GHS-R1a aktivációján keresztül jön létre - annak hátterében más receptoriális mechanizmus állhat.

Lehetséges receptoriális mechanizmusok CD36 receptor (koronária szűkület ghrelin analógra, Bodart et al. 2007) GHS-R1b receptor 5-HT2a receptor (bél simaizom kontrakció GHRP-származékra, Depoortere et al. 2006)

CD36 Scavenger receptor, sejtfelszíni fehérje A CD36 közvetíti a ghrelin analóg hexarelin koronária perfúziós nyomást növelő hatását patkány izolált szív modellen. (Bodart et al. 2002) Scavenger receptor, sejtfelszíni fehérje Szöveti eloszlása: zsírszövet, vérlemezke, mikrovaszkuláris endothel sejtek, monocita/macrofág, miokardium Szerepe: zsír metabolizmus, haemostasis, thrombosis, atherogenesis, gyulladás Lehetséges jelátvitel: PKC és L-típusú kalcium csatorna aktiválás Ghrelin CD 36 PKC Ca

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!