Országos Kémiai Biztonsági Intézet Genotoxicitás Mutagén hatások Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea Országos Kémiai Biztonsági Intézet 2011. 11. 17.

A genotoxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja. Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják. Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik.

Mutációk csoportosítása eredetük szerint: spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál pl. tautomerizáció, spontán deamináció indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk. Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: szomatikus germinális Mutációk csoportosítás a hatópont szerint: gén- v. pontmutációk Tranzíció: purin-purin vagy pirimidin-pirimidin csere (A→G, G →A vagy T→C, C →T) Transzverzió: purin-pirimidin vagy pirimidin-purin csere (A →T, A →C, G →T, G →C vagy T →A, T →G, C →A, C →G) Inszerció, deléció: Egy vagy két bázis betoldása vagy kiesése (olvasási keret megváltozása) kromoszóma mutációk

Pontmutáció hatása a géntermékre: csendes mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt kódolja. AGT (Ser) → AGC (Ser) semleges mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti. AAA (Lys bázikus) →AGA (Arg bázikus) misszensz mutáció: Egy báziscsere miatt másik nem funkcióképes aminosav kódja keletkezik. GAG (Glu savas)→GTG (Val semleges) nonszensz mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kód keletkezik. TAC (Tyr) →TAG (Stop) kereteltolódási mutáció (frameshift): Egy vagy két bázis kiesése vagy hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret. A

Bázis tautomerizáció (spontán m.) Guanin és timin keto formában Adenin és citozin amino formában A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

Mutagén tényezők sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok) molekulákat gerjesztik és ionizálják, sejtben sok vízmolekula→szabadgyökök kémiai anyagok: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok

Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz (aminocsoport→oxocsoport) pl. salétromossav citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Környezeti mutagén anyagok Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid akrilaldehid Propán-szulfon Dimetil-szulfát Dietil-szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán Etilén-klorid Vinil-klorid élelmiszeradalékok: nitritek nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat Bruce Ames 1970-es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas Daganatos betegségek, fertilitási problémák, genetikai betegségek (pl. albinizmus) Mutáns prokarióta sejtek (Escherichia coli és Salmonella typhimurium) Aminosav szintetizáló képesség károsodott A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció vagy reverzió) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 metabolikus oxidációs rendszer Kísérleti állatok kezelése Enzim termelődésének növelése→inducer S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások

Teszttörzsek E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Hisztidin és triptofán mentes táptalajon inkubálás Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Negatív és pozitív kontroll kell

Egyéb genetikai módosítások Cél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása (ellenőrzés kristályibolyával) uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia Törzsek ellenőrzése szükséges

Alkalmazott törzsek genotípusa Mutáció génje Mutáció típusa DNS-repair LPS Plazmid TA98 hisD Frameshift uvrB rfa pKM101 TA100 hisG Bázispár szubsztitúció TA1535 - TA1537 hisC WP2 uvrA trp uvrA

Alkalmazott törzsek fenotípusa TA98 TA100 TA1535 TA1537 WP2 uvrA Hisztidin szükséglet + - Triptofán Kristályibolya érzékenység ++ UV érzékenység Ampicillin rezisztencia Spontán revertánsok 20-50 75-200 5-20 8-50

A vizsgálat menete 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulása Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc) Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés)

(Mutagén anyag vizsgálata)

Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll) A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.

Ames II. módosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) baktériumok + teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) automatizált, kisebb mennyiség is elég

In vivo mikronukleusz Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normoblast→polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező polikromáziás eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

Állatok kezelése intraperitoneálisan vagy per os (szájon át) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport (több dózis, hím és nőstény állatok) Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás→csontvelő fötális borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták (normociták) között Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül

Értékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány Statisztikai értékelés