MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

MUTAGÉN Az emberi szervezetre, annak természetes és mesterséges környezetéből nagyszámú toxikus tényező fejtheti ki hatását, melyek egy része a sejtek genetikai állományát is károsítja! Egyik lehetséges mód: MUTÁCIÓ Watson és Crick 1953: DNS kettős spirálszerkezetének és önreprodukciós képességének kimutatása

DNS kettős spirál szerkezete

Szemikonzervatív replicatio: DNS sejtosztódás előtti megkettőződése Szemikonzervatív, mert az egyik lánc az eredeti DNS molekulából származik a másik újonnan szintetizálódik DNS replicatio során létrejöhetnek „hibák” mutációk következő megkettőződéssel továbbadódik, ha nem keletkezik ellentétes mutáció (reserv) Mutáció a genom megváltozása Gyakorlati szempontból: pontmutáció, kromoszóma aberratio A legtöbb mutáció spontán és váratlan

DNS-molekula szemikonzervatív replicatioja

Benignus polimorfizmus A kimutatott mutációnak ‘nincs’ klinikai relevanciája Genetikai értelemben akkor használjuk, amikor olyan mutációt takar, amelyek genetikailag még nem mutathatók ki azon egyéneknél akiknél a klinikai relevanciák megtalálhatók Kockázati mutáció A betegség kialakulását nem okozza, de a betegség kialakulásához hozzájárul a jelenléte

Mutáció szűrési módszerek A mutáció szűrési eljárások során keressük a betegséget / szindrómát okozó mutációt, vagyis a mutáció elváltozás / betegség kapcsolatot derítjük fel! Linkage analízis: Eltérő DNS polimorfizmusokat keresünk a beteg és a kontroll DNS-ében Ismert mutáció kimutatása: annak eldöntésére végezzük, hogy az illető a kérdéses megbetegedésben szenved-e, vagy annak kockázatát hordja-e a génszerkezetében Ez a leggyakrabban használt eljárás A betegségért felelős mutáció keresése:Keressük az adott betegségben szenvedők adott génjében azokat a mutációkat, amelyek csak a betegeknél mutathatók ki

A betegségért felelős mutáció(k) keresési stratégiája A gén adott szakaszait PCR reakcióval amplifikáljuk Az így nyert DNS-ben mutáció szűrési eljárásokkal mutációt keresünk A mutációt nukleotid szekvencia analízissel azonosítjuk Vizsgáljuk, hogy a talált mutáció benignus polimorfizmus, vagy betegségért felelős mutáció Vizsgáljuk a mutáció hatását a DNS szekvenciára, aminosav összetételre, fehérje szerkezetre

Mutáció szűrési eljárások DGGE: Denaturáló grádiens gél elektroforézise TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elektroforézise SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai Heteroduplex analízis CFLP:Heteroduplexek vágása 1.Kémiai módszerrel történő vágás 2.Enzimatikus módszerrel történő vágás 3.Speciális enzimmel történő vágás Mismatch binding proteinek kötődésén alapuló eljárás PTT

TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elktroforézise

SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai

A mutáció azonosítása nukleotid szekvencia analízissel 1.A kérdéses gén szakaszról PCR segítségével másolatot készítünk 2.A PCR azonosságát és tisztaságát ellenőrizzük 3.Nukleotid szekvencia meghatározás 4.A szekvenálást mindkét irányból el kell végezni 5. A mutáns és kontroll szekvenciájának összehasonlítása

PCR: polimeráz láncreakció

Heterozigóta mutáció kimutatás PCR-SSC, nukleotid szekvencia analízissel Pedigre PCR-SSCP analízis Heterozigóta mutáns szekvencia Vad nukleotid szekvenciája

PCR-SSCP

Felhasznált irodalom: Dr. Papp Zoltán: Klinikai genetika DE-OEC: Alapvető Molekuláris Biológiai Módszerek (Debrecen 2003.) Kép: Internet Készítette: Kolocsán Tünde Biológia-környezetvédelem II. évfolyam Nyíregyháza, 2004. November 13.

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!