Molekuláris farming kutatása, fejlesztése és alkalmazása növényeknél Dr. Miskei Márton DE, AMTC, MTK, Kertészettudományi és Növényi Biotechnológiai Tsz.

DNS Az RNS virusok kivételével az élőlények örökítő anyaga a DNS (dezoxiribonukleinsav)

A növények genomi DNS-e a sejtmagban található kromoszómákba kondenzálódva

A növények extranukleáris DNS-e a mitokondriumokban és a plasztiszokban található gyűrűs formában

A transzkripció és a transzláció folyamata

Géntechnológia: Növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai változtatása molekuláris biológiai módszerekkel GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus) növények: Olyan növények, melyek genetikai állományába a géntechnológia molekuláris genetikai módszereivel idegen gént (transzgént) juttatnak be, amely beépűl, működik és öröklődik.

A géntechnológia történeti áttekintése 1979 Az első kísérletek a növényi géntechnológiában 1980-as évek Transzformációs rendszerek kidolgozása 1983-84 Az első transzgénikus növények Fraley és mtsai. Horsch és mtsai. De Block és mtsai.

A géntechnológia történeti áttekintése 1986 Az első vírus- (Powel és mtsai., Baulcombe és mtsai.), rovar- (Vaeck és mtsai.), herbicidrezisztens (Shah és mtsai.) GM növények 1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA) 1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete (Európa) 1994 GM növény forgalomba kerülése

A géntechnológia történeti áttekintése Első generációs transzgénikus növények A mezőgazdasági termelés segítése (vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid reszisztencia) Második generációs transzgénikus növények A növények anyagcseréjének és fejlődésének módosítása (fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés, hímsterilitás) Harmadik generációs transzgénikus növények Különféle speciális anyagok előállítása (élelmiszeripar, műanyagipar, gyógyszeripar)

Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított növényekkel „Molecular pharming” Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított növényekkel (emberi fehérjék, antitestek, vakcinák) Transzformáció: A transzgén bejuttatása a növénybe Transzgén bejuttatása protoplasztokba Transzgén bejuttatása génpuskával Transzgén bejuttatása Agrobacterium tumefaciens fertőzéssel

I. Transzgén bejuttatása Agrobacterium tumefaciens fertőzéssel Az agrobaktériumok a kétszikü növényeket fertőzik a sebzési helyeken A fertőzött növényeken tumorképződés

Vektorok Extrakromoszómális DNS, baktériumokra és egysejtű gombákra jellemző A jobb túlélőképességhez szükséges géneket tartalmazzák pl.: rezisztencia gének Képes önállóan osztódni, így átkerül az utódsejtbe Génsebészeti módszerekkel egyszerűen manipulálható

Agrobaktérium-fertőzés

Ti plazmid felépítése

Nicotiana tabacum (dohány) Gyorsan nő, kevés törődést igenyel Genomja ismert Régóta használják a növénygenetikában Szöveteiből könnyen regenerálható új növény

Transzformáció Fertőzés agrobaktérium szuszpenzióval Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat

II. Transzgén bejuttatása protoplasztokba Regeneráltatás és szelekció A növényi sejtek sejtfalát leemésztjük A protoplaszt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS-t Elektroporáció PEG (Polietilén-glikol) kezelés Regeneráltatás és szelekció

III. Transzgén bejuttatása génpuskával Néhány um átmérőjű wolfram vagy arany részecskére adszorbeált plazmid molekula Génpuska nagy sebességgel lövi be a szövetekbe a plazmidot A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része eltalálja a sejtmagot Integrálódik a bevitt DNS a genomba

Antibiotikumot tartalmú regenerációs táptalaj Transzformálás Antibiotikumot tartalmú regenerációs táptalaj

Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat

Legújabb transzformációs rendszerek Kloroplaszt transzformáció Mitokondrium transzformáció A gének expressziójának szabályzása Külső szignal kapcsolja az expressziót Az expresszió csak bizonyos szövetféleségekben indul el Mesterséges kromoszóma

Penicillium chrysogenum antifungális fehérje (PAF) termeltetése transzgénikus dohány (Nicotiana tabacum) növényben

Bevezetés növény transzformálás harmadik generációs transzgénikus növények fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség, alacsony költség) célkitűzés: transzformációs technikák elsajátítása modellszervezet: dohány modellfehérje: PAF

Modell rendszerek Dohány (Nicotiana tabacum) transzfromációs rendszerek gyorsan növő, könnyen regenerálható PAF - Penicillium chrysogenum antifungális fehérje kis moltömegű, bázikus, ciszetinben gazdag rendellenes hifák, gátolt szaporodás 276 bp 96 aa Lokalizáció Összeszerelődés PAF Pre Mature PAF Pro

Transzfromálási technikák nukleáris transzformálás Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid T-DNS szakaszba transzgén kloroplaszt transzformálás homológ rekombináció magas expressziós színt nincs pollentranszmisszió LTR LTR Szelekciós marker Szelekciós marker Vad típusú plasztisz DNS LTR Transzformált plasztisz DNS transzgén RTR transzgén RTR RTR

Nukleáris transzformálás I. klónozó vektor szerkezete jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák kanamycin szelekciós marker PAF kazetta LB S35 Kanamycin szelekciós marker Tnos P2 PAF kazetta Tnos RB

Nukleáris transzformálás II. PAF Pre Mature PAF Pro Tnos P2’ Pre-Pro-mature-PAF PAF Pre Mature PAF Pro Pre-Pro-mature-PAF+ozmotin P2’ ozmotin PAF Pre Mature PAF Pro Tnos P2’ GE Tnos GE+Pre-Pro-mature-PAF PAF Pre Mature PAF Pro Tnos P2’ 38P 38P+Pre-Pro-mature-PAF Tnos PAF Mature PAF mature-PAF P2’ PAF 38P+mature-PAF Mature PAF Tnos P2’ 38P

Nukleáris transzformálás I. klónozó vektor szerkezete jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák kanamycin szelekciós marker PAF kazetta Agrobacterium tumefaciens transzformálása növények fertőzése regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós táptalajokon regenerált növények vizsgálata DNS, RNS szinten 1 kb –os standard negatív kontroll paf pozitív kontroll LB Kanamycin szelekciós marker S35 RB PAF kazetta P2 Tnos

Kloroplaszt transzformálás I. klónozó vektor szerkezete jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia, transzgén transzformálás génpuskával LTR aadA szelekciós kazetta Prrn Pro Mature PAF trnC RTR

Kloroplaszt transzformálás II. transzformánsok szelektálása spectinomycin streptomycin spectinomycin tartalmú regenerációs táptalaj

Kloroplaszt transzformálás I. klónozó vektor szerkezete jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia transzformálás génpuskával regenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokon transzgén beépülésének vizsgálata DNS szinten pozitív kontrollok paf 1 kb-os standard negatív kontroll Prrn aadA szelekciós kazetta Mature PAF trnC RTR LTR Pro 1. 2.

Összefoglalás több vektorkonstrukció tervezése nukleáris transzformálás kloroplaszt transzformálás transzformánsok bizonyítása DNS, RNS szinten tervek: kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság vizsgálata Sothern blot technikával termelődött PAF fehérje kimutatása Western blot technikával PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a növényben gombafertőzés hatására más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje természetű anyag termeltetése növényekkel további növényen kidolgozni a transzfromációs technikákat

A GM növények fogadtatása Multinacionális cégek Mérlegelni kell! Zöld szervezetek (pl.: Greenpeace) Multinacionális cégek http://www.greenpeace.org/india/news/gm-indian-food-greenpeace-flags-the-good-the-bad

A GM élelmiszerek egészségkárosítása Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni? „Nincs bizonyíték, hogy nem károsak.” „...egy génkezelt krumplifajta kóros elváltozásokat okoz az ezzel táplált patkányokon...”

A GM élelmiszerek egészségkárosítása Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni? „2008-ban 25 országban ... 13,3 millió gazda foglalkozott genetikailag módosított növények termesztésével.” „Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények termesztésével.”

A GM élelmiszerek egészségkárosítása Tények! Allegizálhat a transzgénről expresszálódott fehérje A transzgén károsan befolyásolhatja a növény fiziológiai folyamatait Antibiotikum rezisztenciát alakíthat ki A transzgén önmaga veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem jelenik meg az élelmiszerben A hatékony védelem rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkül Nagyobb terméshozam, egészségesebb, védettebb növény

A GM élelmiszerek egészségkárosítása Konklúzió Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt! A hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran károsabb Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium betartásával: A cégtulajdonosok vállaljanak felelősséget a termékeikért Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább szakmai körökben) Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót, nehézfémet... Legyen vizsgálva az allergizáló hatása, és okoz-e toxicitást Legyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség problémáján

A GM növények ökológiai hatása Jelentősebb az ökológiai kockázat „A természeti környezetbe való kijutásával a génmódosított élőlény beporzással, vagy a magok kihullása révén ellenőrizhetetlenül kereszteződhet más, rokon fajtákkal, így “elszennyezve” azok genetikai állományát.” „A ma termesztett génmódosított növények 99%-a gyomirtószerekkel, illetve kártevőkkel szembeni ellenálló-képességet hordoz, amely tulajdonságok a fogyasztó számára semmilyen kézzelfogható előnnyel nem járnak.”

A GM növények ökológiai hatása Jelentősebb az ökológiai kockázat „Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag módosított növények termesztésével. ” „A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó francia és német kísérletek alapján legfeljebb 20 m izolációs távolság szükséges a genetikailag módosított és hagyományos kukorica tábla között, a 0,9 százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A 0,9 % alatti véletlenszerű keveredés a biotermékek esetében is megengedett az Európai Uniós szabályozás alapján.”

A GM növények ökológiai hatása Tények Létezik a pollentranszmisszió Olcsóbb az élelmiszerek előállítása Felfigyeltek a kutatók is a kockázati tényezőkre Gyakran GM növények végzik a környezeti károk felszámolását (nehézfém mentesítés)

A GM növények ökológiai hatása Konklúzió Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai kockázatot (kloroplaszt trasnszformáns, szabályozott expresszió) Ne termesszék egymás közelében a transzgént tartalmazó növényt és az azzal rokon vad típusú növényt Ha biztonságos és olcsó egyben, akkor alkalmas a nagymennyiségű élelmiszer előállításra Alternatíva a zárt rendszerű nagyüzemi termelés (bioreaktor, nagyüzemi üvegház)

A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag előállításra Zárt rendszerben, megfelelő ipari technológiával hatékonyan termelhető és kivonható a kívánt alapanyag Alkalmas ipari alapanyag előállítására, kiváltva költségesebb, környezetet károsító technológiákat Nagymennyiségű, biztonságos vakkcinák előállítására, hormonok és más drága enzimek előállítására használható Előállíthatóak olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje természetű alapanyagok létrehozhatók

A GM növények szigorú szabályozása EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért biztonságos, de gyakran nehézkes a GM növények termesztése, előállítása EU színten szúrópróbaszerűen ellenőrizhetőek az egyes laboratóriumok, cégek Magyarországom a FVM foglalkozik a laboratóriumok akkreditálásában Komoly engedélyeztetési eljárás Szigorú hulladékmegsemmisítés és szállítás

Elfogadjuk a GM növényeket? Gondolkozzunk józanul! http://www.eurekastreet.com.au/article.aspx?aeid=8150 http://www.wired.com/techbiz/people/magazine/15-07/st_kia Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni? Gondolkozzunk józanul!

Köszönöm a figyelmet