KÖRNYEZET(VÉDELM)I BIOTECHNOLÓGIA Bevezető előadás

A bennünket körülvevő élő és élettelen világ környezet A bennünket körülvevő élő és élettelen világ biotechnológia biológiai anyagok, folyamatok ipari szintű ki/felhasználása környezetvédelem környezetünk megóvása, rendbetétele ‘RRR’ (reduce, reuse, recycle) Környezeti biotechnológia Célja: a környezeti problémák gyors és hatékony kimutatása, megoldása biotechnológiai módszerekkel Mivel foglalkozik: bioremediáció, hulladékkezelés, víztisztítás, környezeti monitor, nyersanyag-, termék kinyerés, bioüzemanyagok

A környezet és védelme A természetes környezet fő elemei: Föld, víz, levegő, élővilág A környezet fogalma azonban az ember által mesterségesen létrehozott elemeket is tartalmazza kölcsönhatás A civilizáció terjedésének következménye az egyensúly felborulása környezet károsodása Számos, látványos környezeti katasztrófa kellett ahhoz, hogy az ember komolyan foglalkozzon környezete védelmével Környezetvédelem feladata: megelőzés, megszüntetés, újrahasznosítás, fejlesztés a természet egyensúlyának visszaállítása

Miért van szükség a környezetvédelemre, a környezeti biotechnológiára? A baj akkor kezdődött, amikor az ember többet termelt, mint amennyire szüksége volt, és az iparosodással rohamosan romlott a helyzet Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék veszélyes anyagok szintetikus anyagok Két fő probléma: - hogyan és hova helyezzük - hogyan távolítsuk el A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra: adaptáció

Környezeti szennyezések Szervetlen, szerves, biológiai anyagok Gáznemű, oldott, szilárd Talaj, víz, légszennyezők Gyakran „öreg” szennyezésekről beszélünk, ha régóta jelen van a környezetben pl. bezárt gyárak területén, mezőgazdasági eredetű- peszticid, herbicid maradványok, vagy megbújó, sokáig nem felfedezett esetek Lehet „friss” szennyezés ipari, mezőgazdasági, kommunális tevékenységek során folyamatosan keletkeznek üzemi, kereskedelmi/transzfer balesetek során Manapság egyre több esetben a keletkező hulladék újrahasznosítható (clean technology = tiszta technológia)

Környezeti szennyezések szervetlen: fémek, radioaktív anyagok, nitrát, nitrit, foszfát, cianidok, azbeszt, stb… szerves: természetes eredetű (mezőgazd., kommunális hulladék), szintetikus (peszticidek, PAH, halogén tart-ú vegy.-k), petrokémiai (olaj származékok, BTEX), … biológiai: mikroorganizmusok (patogének, vírusok…) gáznemű anyagok: gázok (kén-dioxid, szén-dioxid, metán, nitrogén-oxidok…) illékonyak (VOCs, CFCs) lebegő részecskék

Mikor kell foglakozni a szennyezésekkel? Minden esetben, de Amennyiben a természetes lebontási, átalakítási folyamat megindul, akkor csak figyelünk (monitor) Ha nincs, vagy nagyon lassú a természetes út, akkor kell aktívan beavatkozni Xenobiotikumok = természetidegen vegyületek Lebontásuk általában nehézkes Lebontásnak ellenálló vegyületek (recalcitrant) Lehet természetes eredetű (pl. klórmetán, fluoracetát) vagy szintetikus

példák Xenobiotikum vagy sem? Klórmetán: lebontása nem ismert illetve nagyon lassú, pedig természetben kb 5x109 kg/év (talaj gombák) szintetikus úton 2x107 kg/év Fluoracetát: a legtoxikusabb (1 g/kg emlős letális dózis) ismert szerves vegyület, mégis 34 növényi faj (pl. Gastrolobium, Oxylobium) termeli, és találtak a természetben olyan baktériumokat, melyek bontani képesek A lebonthatóság vizsgálatához célszerű a vegyület alapszerkezetét, funkciós csoportjait megvizsgálni, és nem feltétlen azt elemezni, hogy xenobiotikum vagy sem

Környezeti biotechnológia A környezet megóvására nagyon régóta használunk bio-technológiai módszereket Több ágra osztható: Bioremediáció Megelőzés Detektálás és monitorozás Genetikai mérnökség Utóbbi években erőteljes kutatás-fejlesztés folyik a Bioüzemanyagok előállítása Nyersanyag kinyerése (pl. biobányászat) terén

Bioremediáció Remediáció = gyógyítás Bioremediáció A szennyezőanyagok környezet károsító hatásának csökkentése, vagy megszüntetése, a szennyezett talaj, vizek „meggyógyítása” Bioremediáció olyan technológiai eljárás, mely biológiai rendszereket használ a környezet megtisztítására a (toxikus) szennyezőanyagoktól. Általában mikroorganizmusokat és növényeket használunk e célra. Hatékonyságát számos környezeti tényező befolyásolja Biodegradáció a szennyezőanyagok biológiai úton történő lebontása, mely környezetvédelmi szempontból a legmegfelelőbb megoldás, ez esetben nem marad vissza káros mellék-, vagy végtermék

Megelőzés (tiszta technológiák fejlesztése) Modern világunkban a korszerű, környezetbarát technológiák jelennek meg az iparban Előnye: kisebb a környezet terhelése, kevesebb veszélyes terméket állítunk elő, kevesebb a hulladék, toxikus melléktermék, stb. A cégeknek kármentesítésre kevesebbet kell költeni Folyamatok fejlesztése pl. enzimek használata nem biológiai katalizátorok vagy korrozív vegyszerek helyett Termék fejlesztés: pl. bioműanyagok bioüzemanyagok

Szennyezések kimutatása, monitorozása Figyelni kell a szennyezések megjelenését, változásait. Monitorozzuk a mikrobiális aktivitást, az ökológiai hatásokat Számos kémiai módszer létezik In situ monitorozásra a legmegfelelőbb megoldás bioindikátorok, biomarkerek, bioszenzorok alkalmazása A bioindikátorok ép szervezetek, melyek természetesen előfordulnak az adott környezetben, és a populációjukban történő változás ad információt a környezetet ért szennyezés hatásáról A biomarkerek egy szervezet fiziológiai, biokémiai, vagy molekuláris jellemvonásai, melyekre hat a szennyezés A bioszenzorok módosított, vagy specifikus enzimek, akár teljes (esetleg genetikailag módosított) katabolikus utak, melyek a környezetben megjelenő szennyezések, toxikus anyagok korai (kvantitatív) kimutatásában játszanak fontos szerepet

Monitorozás A szennyezések kimutatása mellett, a kármentesítő folyamatokban résztvevő mikróbákat is figyelemmel kell kísérnünk, valamint az ökológiai hatásokat is meg kell vizsgálnunk Mikroorganizmusok detektálása, monitorozása: gyakran alkalmazunk laborban felszaporított mikroorg-kat (bioaugmentáció), melyek (különösen, ha genetikailag módosított) jelenlétének, aktivitásának nyomonkövetése fontos a hatékonyság megállapítása érdekében. Gyakran a mikróbák jelölésével segítik a detektálást Ökológiai hatások vizsgálata: a bioremediációs eljárás alkalmazható-e az adott környezetben, a technológia lépései, és a keletkező intermedierek nem veszélyesek-e az ökoszisztémára, az alkalmazandó mikróba nem termel-e a növények, a környezet számára toxikus anyagokat

Genetikai mérnökség A különböző szervezetek genomjának feltérképezése kapcsán olyan lehetőségek birtokába jutottunk, melyet felhasználva pl. környezeti hatásoknak ellenálló növényeket, aktívabb mikroorganizmusokat stb. tudunk létrehozni. Ennek előnye, hogy kevesebb vegyszert kell használnunk, rövidebb idő alatt megy végbe a bioremediáció…

Szennyezések eltávolítására megoldások Fizikai- Kémiai- módszerek Biológiai- Kombinált megoldások Miller Environmental Technologies Working For a Green Future

Bioinformatika szerepe a környezeti biotechnológiában az ismert reakciók csoportosítása, hipotetikus lebontási útvonalak felállítása a funkciós csoportok alapján, egy/több mikróba kiválasztása A kísérletes munkát segíti, rövidítheti A Minnesota Egyetemen létrehozott rendkívül hasznos internetes oldal: http://umbbd.ahc.umn.edu/index.html (Welcome to MetaRouter)

Dibenzothiophene Degradation Pathway [Compounds and Reactions] [BBD Main Menu] This pathway was started by Gulin Oz and completed by Dong Jun Oh, University of Minnesota. Dibenzothiophene (DBT) is representative of a group of sulfur-containing heterocyclic organic compounds. No organism has been shown to degrade DBT completely. Mormile and Atlas (1988) examined the degradation of 3-hydroxy-2-formylbenzothiophene and reported release of CO2 from the ring structure of DBT under aerobic conditions. This study suggests that a succession of microbial organisms is neccesary to degrade 3-hydroxy-2-formylbenzothiophene further. The exact names of the enzymes in the pathway are not cited in the literature, only the DOX operon which encodes them in its 9 open reading frames (ABDEFGHIJ). The pathway is very similar to the one of naphthalene and the corresponding names have been used for the enzymes. This pathway can be contrasted to the Dibenzothiophene Desulfurization Pathway, which retains the full fuel value of the compound while eliminating the sulfur. The following is a text-format dibenzothiophene degradation pathway map. An organism which can initiate the pathway is given, but other organisms may also carry out later steps. Follow the links for more information on compounds or reactions. This map is also available in graphic (13k) format.

Metarouter represents data derived, with permission, from the University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database (UM-BBD, http://umbbd.ahc.umn.edu/), obtained on May, 2002.

Biotechnológia (+ mikrobiológia, biokémia) alapok

Bio-technológia Biokémia Biológia Kémia Bio- Kémiai mérnökség Mérnöki tudományok

A biotechnológia fogalma “biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all lines of work by which products are produced from raw materials with the aid of living things” - egy olyan munkafolyamat, melynek során keletkező terméket élő szervezetek segítségével állítjuk elő 1961 után (Carl Göran Hedén nevéhez fűződve) úgy fogalmazták meg: „the industrial production of goods and services by processes using biological organisms, systems, and processes.” – biológiai szervezetek, rendszerek, folyamatok használatával történő ipari termelés Ma: EFB (= Európai Biotechnológiai Egyesület) definiciója szerint: a biokémia, mikrobiológia és mérnöki tudományok integrált alkalmazása azért, hogy a mikroorganizmusok, állati-, növényi sejttenyészetek, vagy részeik képességét használni tudjuk az iparban, mezőgazdaságban, egészségügyben, és a környezetvédelemben OECD (= Szervezet a Gazdasági Együttműködésért és Fejlesztésért) definiciója: tudományos és mérnöki alapelvek alkalmazása az anyagok biológiai ágensekkel történő „megmunkálására” termék nyerése céljából

A biotechnológia 3 ága (és színe) Piros biotechnológia = humán egészségügyi biotechnológia Gyógyszerek, terápiás szerek biotechnológiai megoldásokkal történő előállítása pl. inzulin, interferon, védőoltások Fehér biotechnológia = ipari biotechnológia Termékek előállítása biotechnológiai módszerekkel pl. bioműanyagok, bioetanol, szerves savak, mosóporokba enzimek Zöld biotechnológia = növényi biotechnológia A környezeti faktorokkal szemben ellenállóbb növények létrehozása biotechnológiai módszerek segítségével Bioműanyag lökhárító

A biotechnológia biológiai rendszereket használó technológia Bármely biológiai rendszer alapegysége a sejt Vad típusú vagy genetikailag módosított sejteket illetve a sejtalkotók valamelyikét alkalmazzuk céljainktól függően

Mikroorganizmusok és kimutatásuk algák, baktériumok, gombák, protozoák Fajok csoportosítása, sejtfelépítés, metabolikus folyamatok, enzimek mikrobiológia, biokémia Egyesek szabadon élnek, mások biofilmet képeznek, vagy kevert közösség tagjai. Előfordulnak a természetes környezetünkben a felszíni, felszín alatti vizekben, talajban, növényeken és a rizoszférában, sőt bennünk, emberekben is, pl. a béltraktus nélkülözhetetlen segítői. A környezetvédelem szempontjából nagyon fontos, hogy a mikroorganizmusok jelenlétét, a konzorciumok összetételét, változását nyomon tudjuk követni.

Prokarióta sejtköpeny A sejteket védő takaró a mikroorganizmusok szempontjából rendkívül fontos, különösen biotech-nológiai folyamatokban, bioremediációs eljárásokban LPS (lipopoliszaharid)

Gram festődés Gram pozitív baktérium Gram negatív baktérium Bacillus cereus Eschericia coli

Inclusion bodies Bacillus megaterium PHA inclusion-body kapcsolt fehérjéje = PhaP (zöld gyűrűk). a sejtek anyagtárolására szolgáló képződmények, főleg tartalék tápanyag raktározására szolgálnak, PHA = polihidroxi alkánsavak pl. polihidroxi-butirát (akkumulálódhat aerob, anaerob, heterotróf, autotróf baktériumok-ban is) Egyéb: protein, glikogén granu-lumok, polifoszfát granulumok, … Ipari-, bioremediációs jelentőség A fehér granulumok az ‘inclusion body’-k (zárványtestek) a sejtekben

metabolizmus Alapvető fontosságú a sejtek metabolizmusának ismerete, ha sikeresen akarjuk használni biotechnológiai célokra Mi a metabolizmus: reakciók sorozata, mely során a sejtek energiát nyernek, és alapanyagokból felépítik sejtépítő elemeiket Az energia metabolizmus anabolikus és katabolikus reakciókkal kapcsolt Energianyerés szempontjából két osztály: fototrófok- energiájukat közvetlenül a napsugárzásból nyerik, kemotrófok redox reakciók segítségével nyernek energiát, melynek forrásai szerves anyagok A sejtekben a kémiai reakciók nem spontán következnek be, hanem enzimek (katalizátorok) segítségével

membrántranszport Egy-két kivételtől eltekintve (oxigén,széndioxid, víz, ammónium) a molekulák specifikus transzport segítségével jutnak be a sejtekbe, ebben a membrán proteinek fontos szerepet játszanak A makromolekulák transzportja történhet exo-, endocitózissal

Sejtek számának meghatározása A biotechnológiai eljárásokban fontos, hogy ismerjük az aktív/élő sejtek számát, melyek résztvesznek a biotechnológiai folyamatokban Sejtek számát meghatározhatjuk közvetlen mikroszkópikus számolással (össz-sejtszám, élő és holt együtt) vagy lemezelés módszerrel, mely során csak az élő, telepet képző sejteket detektáljuk, illetve az un. MPN (most probably number), mely a legvalószínűbb élő sejtszámot adja. De meghatározhatjuk a sejtek száraz súlyát, turbiditását (ált. 600 nm), esetleg összfehérje, specifikus enzimaktivitás meghatározással. Buerker számláló

CFU = colony forming unit Telepképző sejtszám

A Coulter számláló (Coulter Counter) A részecskék mennyisége, mérete meghatározható a kapillárison áthaladó sejtek kapcsán keletkező elektromos jelek alapján Rokona az áramlási citométer, mely festett sejteket érzékel (pl. fluoreszcens festés)

Ipari biotechnológia kulcslépései Nyersanyag Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy transzformációra Nyersanyag előkészítés Fermentáció, biotranszformáció Fermentáció,transzformá-ció: bioreaktorokban sejtszaporítás, antibiotikum, fehérje, stb. előállítás termék kinyerés, kiszerelés Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése Termék

Az ipari biotechnológiai eljárásokban leggyakrabban használt mikroorganizmus csoportok Pseudomonas Sphingomonas Bacillus Rhodococcus Clostridium Streptomyces Methanotrófok Methanogének Tejsav baktériumok élesztők

Pseudomonas fajok jellemzése, jelentősége Proteobacteria – törzs Gammaproteobacteria - osztály Pseudomonadales – rend Pseudomonadaceae – család Pseudomonas – nemzettség - A talajmikroorganizmusok legdominánsabb csoportja, többségük képes több xenobiotikus anyagot bontani (> 100 kül. szerves vegyület) Gram negatív, aerob pálcák, főleg a mezofil körülményeket kedvelik - ált. a molekuláris oxigént használják, de néhány faj képes végső e- akceptorként a nitrát oxigénjét használni - Kemoorganotrófok (energianyerés szerves anyagokból) Flagellum, főleg poláris Pigment, két csoport: fluorescens ill. nem fluorescens Felületaktív anyagok (rhamnolipidek) fitohormonok – siderophore pl. pyoverdine (vas felvételben fontos szerep) oxigenázok ill. hidrolitikus enzimek, pl.proteázok, lipázok

Biotechnológiai jelentőségük Plazmidok – számos fenotipikus tulajdonságért felelősek pl. rezisztencia, degradatív enzimeket kódoló gének PHA akkumuláció (tartalék tápanyagként) a nem fluorescens pseudomonasokban - biopolimerek előállításában fontos szerep (biodegradálható műanyagok) Bioremediáció, biodegradáció – xenobiotikumok bontása: aromás-, halogén tart. vegyületek, műanyagok, oldószerek… szerepük jelentős, részben, mert szaporításuk ált. egyszerű, nem finnyásak lebontásban oxigenázoknak kulcsszerep, ill. zsír- (lipázok, észterázok), cukorbontó (a-amiláz) enzimek Felületaktív anyagaikkal a hidrofób jellegű vegyületek hozzáférését segítik elő (szénhidrogének, halogén tartalmú vegyületek) Sejtfal felépítésben több faj esetén alginátot találunk – védő funkció

Mezőgazdasági jelentőségük Növény-talaj-mikroorganizmus kapcsolat (rhizoszféra) Növények számára előnyös a pseudomonasok jelenléte, ezért, mint biokontroll ágens használják is a mezőgazdaságban (főleg a P. fluorescens-t), általuk kiválthatók lehetnek bizonyos gyom-, rovarírtó szerek Egyes fajok képesek többféle másodlagos metabolitot termelni, pl. HCN, 2,4-diacetil-floroglucinol, indol-3-ecetsav, stb, melyek a növényeket támadó patogének ellen hatásosak Siderophore-ok termelése, a vas-felvételben fontos szerep pioverdinek – vízoldékony fluorescens, sárgászöld pigmentek, kiváló vas-komplexálók ferrioxamin – hidroxamát típusú, a P. stutzeri termeli

Jellemző képviselők P. fluorescens, P. putida, P. stutzeri, P. cepacia P. aeruginosa, P. mallei – ember-, állatpatogén P. syringae – növénypatogén P. putida és P. aeruginosa teljes genom szekvenciája ismert, ezeknek a fajoknak a bioremediációban vezető szerep jutott

Világító karaj Ausztráliában 2005. november 17. 08:31 Sötétben világít a sertéssültem! - újságolta ijedten egy ausztrál férfi egy sydneyi rádióban, és mivel közlése meglehetősen széles körű riadalmat váltott ki, az élelmiszerbiztonsági hatóságok szükségesnek találták, hogy nyugtatólag hozzászóljanak a furcsa felfedezéshez.                                                                                             A szakemberek elmondták: a jelenséget a Pseudomonas fluorescens nevű világító baktériumok okozhatják, amelyek gyakran megtalálhatók a húsban és a halban. Fogyasztásuk - mármint megevésük - ártalmatlan. "Természetes meghökkentő, ha egy étel világít" - ismerte el szerdán George Davey, az egészségügyi szolgálat vezetője. Hozzátette azonban: "A fényt kibocsátó mikroorganizmusok nem okoznak ételmérgezést." Mint a továbbiakban elmondta, a közegészségügyi hatóságokhoz havonta átlagosan két telefonhívás érkezik riadt fogyasztóktól, akik azt jelentik, hogy a hűtőszekrényükben tartott hús világít. Davey teljesen megalapozatlannak nevezte azokat a feltevéseket, amelyek szerint ezt radioaktív sugárzás okozza. Arra azonban nyomatékosan felhívta a figyelmet, hogy amint a hús romlani kezd, az említett baktériumok rohamosan szaporodni kezdenek, és ilyen esetben a fénylő húst feltétlenül ki kell dobni.

Kajszibarack gutaütés betegségének hátterében egy Pseudomonas faj áll A baktériumok szaporodás közben a cukrokat felhasználják, és így a kéregszövet, beleértve a kambiumot is, cukortartalma lecsökken. A kéregszövet alacsony cukortartalma fagyérzékennyé teszi a kajszifát. A baktériumfertőzött kajsziágak kérgében a cukorszint a nem fertőzött ágakhoz viszonyítva 19-48 %-kal csökkent, ami elegendő volt a fertőzött szövetek fagykárosodásához. Mindezek ismeretében most már érthetőbbé válik a kajszi-gutaütés teljes kórfolyamata: A Pseudomonas syringae baktérium képes a csonthéjas gyümölcsfák kéregszövetében télen felszaporodni. Szaporodás közben a cukrokat hasznosítja, így a lecsökkent cukorszint miatt a jégkristályok keletkezése már gyengébb téli fagyok hatására is megindul, és ezáltal a fertőzött szövetek megfagynak. A betegség kórképe azonban csak tavasszal vagy nyáron realizálódik, amikor a törzsben és a vastagabb ágakban a víz- és tápanyagszállító szövetek a téli károsítás miatt már nem tudják feladatukat betölteni.

P. syringae hasznos is lehet! Mesterséges hó nulla fok fölött Cikk dátuma: 2007.06.07. | Szerző: Stani Hol vannak már azok az ötvenes évek, amikor is az Egyesült Államokban feltalálták - egyébként teljesen véletlenül - a hóágyúzást, és néhány év múlva elkészültek az első hóágyúk. Az elmúlt fél évszázad alatt óriási fejlődésen ment keresztül a brancs; így napjainkban már az sem lehetetlen, hogy valamelyik pálmafás tengerparton készítsünk havat! P. syringae hasznos is lehet!

Plazmidok - Kettős szálú cirkuláris DNS molekulák, nem eszenciálisak - Önálló replikáció, de a gazdaszervet fehérjéire, enzimeire szüksége van - 1-200 kb (legkisebb 874 bp - hipertermofil mikroorganizmusból), léteznek megaplazmidok (500- kb) - Lineáris plazmidok is léteznek, pl. Streptomycesekben - Alacsony v. magas kopiaszám - Biodegradációs utak enzimeit kódoló gének kromoszómán plazmidon - Ismertebb „katabolikus plazmidok” pseudomonasokban: TOL (pWWO), NAH, SAL, CAM, …

A Sphingomonasok Proteobacteria – törzs Alphaproteobacteria - osztály Sphingomonadales – rend Sphingomonadaceae – család Sphingomonas – nemzettség Gram negatív, aerob pálcák, szinte mindenhol megtalálhatók Kemoorganotrófok, rendkívüli metabolikus képesség Flagellum, egy poláris Pigment – nem fluorescens, karotinoid pigment = nostoxantin, jellegzetes sárga színt ad a sejteknek (egy-két faj kivétel) Egyedi membrán struktúra – glikoszfingolipideket tart., de a G-negatív fajokra jellemző lipopoliszaharidokat (LPS) nem. A sejtfelszín így savas karakterű, mely tul. az eukariótákra jell. Ez a tulajdonságuk fajmeghatározó bélyeg is poláris lipid profil – az egyes fajokra nagyon jellemző, ami az azonosításban nagy segítség zsírsav profil szintén jellegzetes exopoliszacharid (sejtfelszínen) : gellán – ipari jelentőség

Biotechnológiai jelentőségük Biodegradáció: xenobiotikumok bontása pl. aromás-, szulfonált-, halogén tart. vegyületek, furánok, dibenzodioxin Legtöbbször oxigenolitikus reakciók oxigenázok Ipari biotechnológia: Gellán, exopoliszaharid, melyet elsősorban az élelmiszeripar hasznosít (sűrítő, emulgeáló szerként). Viszkózus, és rendkívül stabil (pH=2-10 tart.). A Sphingomonas elodea termeli, vízben oldható, az agar-agar helyett mikrobiológiai munkákhoz is alkalmazzák alginát liáz (alginát polimer bontása) citoplazmatikus, endolitikus enzim. Az élelmiszer-, textiliparban használt alginát kémiai szerkezetének megismeréséhez, fizikai tulajdonságainak felderítéséhez használják, valamint egészségügyben az alginátot tartalmazó patogének ellen, azok vizsgálatához Jellemző képviselők: S. paucimobilis, S. capsulata, S. elodea, S. subarctica, S. diminuta, S. adhesiva

Van szája a Sphingomonasoknak?

Bacillus-ok Firmicutes – törzs B. licheniformis Firmicutes – törzs Bacilli - osztály Bacillales - rend Bacillaceae – család Bacillus – nemzettség Gram- pozitív, aerob (fakultatív anaerob) pálcák néhány faj képes a NO3--ot, mint végső e- akceptort haszn. Kemoorganotrófok, mezo-, termofilek, alkalofilek (pH > 8,0) Elterjedtek a környezetben hőstabil endospóra Extracelluláris enzimek: proteázok, lipázok, amilázok Toxinokat termelnek baktériumok ellen – polymyxin B (B. polymyxa) pseudomonasok ellen gombák ellen – gramicidin S (Brevibacillus brevis) növények ellen – peptid tipusú toxin (B. cereus) rovarok ellen – d-endotoxin, szúnyoglárvák fejlődését gátolja (B. thuringiensis) ember, állat ellen – antrax (B. anthracis)

Sporuláció Un. kitartóképlet (túlélési stratégia) Külső tényezők endospóra Un. kitartóképlet (túlélési stratégia) Külső tényezők Spóra fala spec. dipikolinát tart. Az endospóra a baktérium sejtben lehet: -terminális -szubterminális -centrális helyzetű B. subtilis endospóra képzése

Ipari, mezőgazdasági, biotechnológiai jelentőségük Mosószer ipar: subtilisin (alkalikus proteáz, B. subtilis termeli), nagyon stabil magas hőmérsékeleten, lúgos körülmények között Hús-, és baromfifeldolgozó iparban keratináz (B. licheniformis) – a keletkező keratin tartalmú szőr ill. toll hulladék feldolgozása/elbontása Élelmiszeriparban, szesziparban a-amiláz ( több faj is termeli, pl. B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens) – keményítő bontása gyógyszeripar, környezetvédelem – glükanotranszferáz (B. macerans) a keményítőből ciklodextrint képes előállítani, mely stabilizáló, csomagoló anyagként haszn. Bacillus clausii különböző vitaminok, különösen a B-vitamin csoport termelésére képes. A készítmény alkalmazásával antitoxikus hatás érhető el. Mezőgazdaság Elsősorban a B. megaterium-ot haszn., szervesanyagok lebontására, átalakítására: a növények számára felvehető formára hozzák azokat mono-, oligomerekre hasítják Bioremediáció felületaktív anyagok hidrofób jellegű vegyületek bontása

Alkalikus proteázok a mosószeriparban B. subtilis

Toll biodegradáció B. licheniformis

Te jó ég, megjöttek a d-endotoxinos bacik szunyogírtás Szegény csemetéink!!! Te jó ég, megjöttek a d-endotoxinos bacik B. thuringiensis

Ismertebb képviselői: B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis, B. clausii, B. stearothermophilus Rovarpatogén: B.thuringiensis Növénypatogén: B. cereus Ember, állatpatogén: B. anthracis Érdekességként megemlítjük, hogy bizonyos anyagok több funkcióval bírnak, pl. subtilisin, enzim és felületaktív anyagként is viselkedik. Több felületaktív anyag toxikus vegyületként hat más szervezetekre

Streptomyces-ek Actinobacteria – törzs Actinobacteria - osztály Actinomycetales - rend Streptomycetaceae – család Streptomyces – nemzettség Gram-pozitív, aerob, kemoorganotróf baktériumok Gombaszerű hifákat képeznek, spóráznak (de ez nem endospóra!!!!) Extracelluláris enzimek, főleg proteolitikus és szénhidrát bontó enzimek Antibiotikus-, gomba ellenes-, bioaktív anyagok - eddig mintegy 10 000 féle antibiotikus tulajdonsággal bíró vegyületet írtak le, melyeket e fajok termelnek, pl. streptomycin, erythromycin, neomycin, puromycin, oxytetracycline, chloramphenicol… antifungális anyagok, pl. nistatin, amphotericin rákellenes anyagok, pl. migrastatin Bioremediáció: fehérje, szénhidrát, szénhidrogén bontás Képviselők: S. fradiae, S. griseus, S.albidoflavus, S. pactum, S. coelicolor, S. erythreus

Rhodococcus fajok Actinobacteria – törzs Actinobacteria - osztály Actinomycetales - rend Nocardiaceae – család Rhodococcus – nemzettség Gram-pozitívak, aerobok, nem mozognak, elterjedtek a körny-ben Morfológiailag pálcák és coccus szerű formák, micéliumos szaporodás Sejtfal egyedi, mikolátot tartalmaz hidrofób jelleg Felületaktív anyagok: celluláris, extracelluláris Flokkulánsok: polipeptid és lipid rész Nagy lineáris plazmidok Bioremediációban: olajos szennyeződések komponenseinek bontása, főleg alifás szénhidrogéneket, deszulfurizáció Bioszenzorként is használják Képviselők: R. rhodochrous, R. erythropolis, R. globerulus, R. roseus, R. ruber

Biotechnológiai jelentőség Bioremediáció Alifás, aromás szénhidrogének bontása Felületaktív anyagok részvételével Oxigenáz enzimeik segítségével Deszulfurizáció Szerves kötésben lévő kén eltávolítása a szerves vegyületekből (üzemanyagokban tiofének) Ipari jelentőség Nitriláz enzim, fontos transzformációkat katalizál, pl akrilsavból akrilamid, segítségével amidok, antimikobakteriális ágensek, vitaminok előállíthatók Környezeti monitor Bioszenzorként főleg szénhidrogén szennyezések detektálására Egyik törzs heroin észteráz enzimet képes termelni, ezzel a heroin detektálható Egy másik törzs fenilalanin dehidrogenáza segítségével a fenilketonuria (recesszíven öröklödő genetikai anyagcserezavar) betegség detektálható

Rhodococcusok hidrofób jellege Jelentősége: a sejtek hidrofób jellegét a sejtfalban található alifás mikolinsav láncok okozzák, melyek lehetővé teszik a hidrofób szennyeződésekhez való jobb hozzáférést Több típusú felületaktív anyagot is termelnek: Celluláris – mikolinsavak (két fázis határán felületnövelés) Extracelluláris – diszpergálják a hidrofób komponenseket Bioflokkuláns anyagokat is termelnek A szuszpendált szilárd anyagok flokkulációja, polipeptid és lipid (főleg mikolát tartalmú glikolipidek) részből állnak Habképzők, ez a bioreaktorokban gondot okozhat, a levegő diffúzióját gátolja

Metilotróf baktériumok Nagyon heterogén társaság „C1 baktériumok” –nak is nevezzük őket, mert 1 vagy 2 szenet tartalmazó (legtöbbször metánt, vagy metanolt) vegyületeket hasznosítanak fő szén- és energiaforrásként Mikroaerofilok, olyan helyeken terjedtek el, ahol egyszerre találnak metánt és oxigént Képviselők: metanotrófok, metilotróf baktériumok (főleg G-), Metilotróf élesztők pl. Pichia, Candida fajok – alkohol oxidáz enzim (alkoholból hidrogén-peroxidot képez) Fakultatív metilotrófok, pl. Methylobacterium sp., metanol hasznosítók Metanotrófok (metán oxidáció) pl.Methylosinus, Methylomonas Monooxigenázok: sMMO, pMMO Metanol dehidrogenáz metanolból formaldehid képzést katalizálja

Ipari biotechnológiai jelentőség Metanolgyártás CH4 + O2 CH3OH + H2O HCHO HCOOH CO2 Bioremediáció: Metán hasznosítók, klórozott szénhidrogének (pl. TCE) bontása Egy sejt fehérje termelés (C1 szubsztrát olcsó, így olcsó biomassza állítható elő) NADH+H+ NAD+ Metán monooxigenáz Metanol dehidrogenáz

Metanogének Euryarchaeota – törzs Volta (1776) Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales - rendek Felfedezésük: lángoló mocsár történet Archaea, obligát anaerobok, nikkel igény Sokféle megjelenés – pálca, kokkusz Előfordulnak metanogén környezetben pl. anaerob emésztők, üledékekben, szennyvíziszapban, talajban, de élő szervezetekben is (emésztő rdsz.) Közös ismertető, hogy a CO2-ot (esetleg metil csoport tartalmú vegy.-t) redukálják, ahol az e- donor H2, formiát lehet, szénforrásként az acetátot kedvelik Pseudomurein tart. sejtfal (antibiotikum rezisztencia), sejt membrán is egyedi (nincs tipikus zsírsav észter) Szulfát, nitrát limitált környezetben Hidrogén termelő törzsekkel szintrófiában élnek Biogáz előállítás 4 H2 + CO2 CH4 + 2 H2O CH3COOH CH4 + CO2 4 CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O

Clostridiumok Phylum: Firmicutes Class: Clostridia Order: Clostridiales Family: Clostridiaceae Genus: Clostridium Nagyon heterogén nemzettség (több, mint 120 faj), mindenhol előford. Pálca formájúak, mozgékonyak –peritrich flagellumokkal Gram pozitív sejtfal struktúrával rendelkeznek Szigorúan anaerobok, tehát metabolizmusuk szigorúan fermentatív, és oxigénérzékenyek Hő rezisztens endospórával rendelkeznek Molekuláris biológiai vizsgálatok szerint nagyon heterogén társaság Néhány faj patogén – fehérje természetű exotoxin az idegi transzmitterek-kel interferál (C. botulinum, C. perfringens, C. histolyticum, C. tetani) Biotechnológiai jelentőségük nagy: fermentatív metabolizmus, oldószer termelés (ABE fermentáció), ammónia asszimiláció, poliszaharidok bontása (cellulóz) C. acetobutylicum, C. thermocellum, C. butyricum, C. sporogenes, C. kluyveri…

Tejsavbaktériumok Phylum: Firmicutes Class: Bacilli Order: Lactobacillales Family: Lactobacillaceae Enterococcaceae Leuconostocaceae Streptococcaceae Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Gram pozitív, nem spóra formáló, anaerob baktériumok, plazmidjaik vannak Tejsav – fő fermentációs termék, a fermentáció spontán lezajlik, ha a rendelkezésre álló állati és növényi szervesanyag tartalmaz elegendő mono-, és diszaharidokat Létfontosságú alkotói az emberi mikroflórának, de bárhol megtaláljuk őket bakteriocinek (nisin) termelése rokon és más baktériumok ellen, szelekciós előny Néhány faj patogén (haemolitikus streptococcusok; enterococcusok) Ipari jelentőség – tejipar, gyógyászat, már K. előtt 3-4 ezer évvel ismerték és haszn. a kovászt, ill. sajt előállító sumérok Pl. Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus thermophilus, Streptococcus pyogenes (streptokinase) Enterococcus faecalis, Bifidobacterium bifidum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus sp.

Ipari, biotechnológiai jelentőségük I Joghurt-gyártás: a Lactobacillus bulgaricus proteolitikus aktivitásának eredménye, peptidek, melyekből egy Streptococcus hangyasavat képez, ez stimulálja a Lactobacillust. A joghurtban a fő aromakomponens az acetaldehid, melynek termelődéséért a L. bulgaricus specifikus aldoláz enzime felelős, treoninból keletkezik. A folyamat 40-45°C-on zajlik Kefir-gyártás: a kefir ‘gomba’ élesztőt (Candida), Lactobacillus-okat, mezofil Lactococcus-okat és időnként ecetsav baktériumokat is tartalmaz. A Lactobacillus kefiranofaciens glikokalixot termel, ez tartja egybe a kefir’gombát’. Sajt-gyártás: klasszikus, kemény sajtokban: a sajtalapot 50-55 fokra melegítik, melyet a termofil Lactobacillusok túlélnek, és a lehülés során fermentálják a sajtalapot. A sajt íze, minősége attól függ, milyen Lactobacillus van jelen.

Ipari, biotechnológiai jelentőségük II káposzta savanyítás: szeletelt káposzta + NaCl, a fermentáció Lactobacillusokkal kezdődik Kovász készítés: az élesztő mellett homo-, és heterofermentatív Lactobacillusok is részt vesznek Takarmány silózás: aprított gabona, kukorica – először aerob mikroorganizmusok elhasználják a zárt térből az oxigént, majd anaerob környezetben tejsav baktériumok, tejsavat állítanak elő, egészen alacsony pH környezet kialakulhat, akár 2% tejsav konc. is lehet, melyet ezek a mikróbák túlélnek

Élesztők Fungi (Gombák) Ascomycota (tömlős gombák) Eukarióták, gombák (Saccharomycetales Saccharomycetaceae Saccharomyces cerevisiae) Eukarióták, gombák Szaprofita vagy parazita, (csak egy-két patogén), megtaláljuk őket bárhol, ahol szerves szénforrás biztosított Egyes fajok képesek un. killer toxinok termelésére más fajok ellen Savanyú környezetet kedvelik Metabolizmusuk: cukor fermentáció, alkohol és CO2 keletkezik Több ezer éve ismerik, használják – kenyér, bor, sör előállítás Hasznosítás: élelmiszeripar, gyógyászatban is

Mikroorganizmusok szaporítása Labor méret ipari méretek lombik m3 fermentor Tápanyagok, oxigén ellátás, pH Folyadék kultúra szilárd fázisú fermentáció (SSF) Tápanyagok vízben oldottak szilárd mátrix: szerves: szervetlen: biopolimerek perlit, homok

A mikroorganizmusok kijuttatása a szennyezett területre Folyadék kultúra Szárított forma Immobilizált (hordozóhoz kötött) forma Vagy eleve ott vannak, csak a szaporodásukat segítjük elő