XENOBIOTIKUMOK, ÉS EGYÉB NEHEZEN BONTHATÓ VEGYÜLETEK MIKROBIÁLIS LEBONTÁSA

Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyéb szerves vegyületek XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES EREDETŰ E vegyületek olyan szerkezeti elemeket tart., melyek természetes módon nem jönnek létre, így a mikroorg-k (egyéb szervezetek) evolúciójuk során nem alakítottak ki megfelelő enzimrendszert bontásukra/átalakításukra Tágabb értelemben azok a szintetikus vegyületek xenobiotikumok, melyek bizonyos funkciós csoportok számában és orientációjában eltérnek a természetesen előforduló anyagoktól Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyéb szerves vegyületek Főleg azért jelentenek veszélyt, mert nem ismerjük kellőképpen hatásukat a környezetre, és mivel a természet számára idegen, így a biodegradációja, biotranszformációja sem indulhat meg rövid időn belül Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontására (adaptáció) Egyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék sokféle enzim szükséges mikrobiális lebontási útvonalak

Metabolikus utak szervesanyag O2 Fototróf Kemotróf CO2 Ahhoz, hogy megértsük a mikrobiális lebontási útvonalakat, szükséges a mikroorganizmusok alapműködésének ismerete Metabolizmus = reakciók együttese, mely során a sejtek energiát és kémiai építőelemeket nyernek Energia nyerés szempontjából vannak fototrófok ill. kemotrófok Energia és szénforgalom a bioszférában szervesanyag O2 Fototróf Kemotróf CO2 Hő, entrópia Hő, entrópia

Makromolekulák Oligomerek Monomerek felvétel sejtbe metabolizmus Számos metabolikus út Szükséges elemek, vegyületek felvétele a környezetből (membrán transzport) glükózzal könnyen megy: glükóz prekurzorok építőelemek PO43- NH4+ SO42- fehérjék sejtfal nukleinsavak glükogén O2 Makromolekulák Oligomerek Monomerek felvétel sejtbe metabolizmus Depolimerizáló enzimek hidrolizis

Kometabolikus folyamatok Előfordul, hogy a sejtek nem nyernek közvetlenül energiát egy vegyület lebontásából/átalakításából Ha egy sejt szubsztrátként hasznosít egy vegyületet, a specifikus degradatív enzimeik intenzíven szintetizálódnak. Ezzel az enzimmel, vagy enzimrendszerrel a sejtek képesek lehetnek más, szubsztrátként el nem fogadott, de a sejtek környezetében jelenlévő vegyületeket átalakítani Ez tehát energianyeréssel nem jár, azonban a jelentősége abban lehet, hogy ha e vegyületek toxikusak a sejt számára, akkor képesek ily módon azokat semlegesíteni E képességük annak köszönhető, hogy enzimeik többsége nem szigorúan egy szubsztrátra specifikus (szerkezeti analógia) Mivel a kometabolikus folyamat nem előnyös a sejtek számára, a biomassza koncentrációt növelni, illetve az enzimszintézist fenntartani akkor tudjuk, ha szén-, és energiaforrást (szubsztrát) juttatunk a sejtek környezetébe

Természetben a szennyezőanyagok lebontására összetett mikroba közösségek (konzorciumok) alakulnak ki, melyek szervezett munkával távolítják el a toxikus-, szervesanyagokat környezetükből. Az egyes fajok adottságai, képességei összehangolódnak, egységes rendszerben hatékonyan fejeződnek ki. Olyan xenobiotikus anyagokkal szemben, melyek elektronszívó szubsztituenseket tartalmaznak pl. halo-, nitro-, azocsoportok, a reduktív folyamatokat katalizáló enzimek lesznek hatékonyak

A molekula funkciós csoportjainak hatása Elektron elszívó szubsztituenseket (pl. halo-, nitro, azo- csoportok) tartalmazó vegyületek (magas redoxpotenciál) ellen az oxigenolitikus támadások kevésbé hatékonyak Reduktív, vagy nukleofil mechanizmus Hatékonysága elektrondonorok adagolásával fokozható (A bakteriális anyagcsere (metabolizmus) durva felosztásának alapját az adja, hogy az adott baktérium a növekedéshez milyen szén-, és energiaforrást használ, valamint, hogy az energiatermelő folyamatok során mely anyagok és vegyületek adják az elektront (elektrondonor) és mely anyagok és vegyületek kapják a végén az elektront (elektronakceptor))

Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül Benzoil-CoA konverziója acetil-CoA-vá

Aerob lebontási útvonalak központi intermediereken keresztül

Aerob lebontási folyamatokban a fő szerepet az oxigenázok játszák Alkánok, aromás vegyületek oxidációját katalizálják, melynek eredménye alkoholok, aldehidek, epoxidok, karboxilsavak Ipari-, környezeti- biotechnológiai jelentőség

‘Biohozzáférés’ Egy kémiai komponensnek kapcsolatba kell lépnie a biológiai rendszerrel ahhoz, hogy bármilyen hatás indukálódjon Fizikai-, kémiai paraméterek befolyásolják: Vízoldhatóság nem vízoldékony (hidrofób) anyagok esetén ‘direkt’ felvétel – specifikus sejtfelszíni tulajdonságok Illékonyság Funkciós csoportok száma a vegyületen pl. klórozottsági fok környezeti faktorok (hőmérséklet, pH, nedvességtartalom)

Halogén tartalmú vegyületek Többségük ember alkotta vegyület pl. oldószerek, vegytisztitó-szerek, peszticidek. Mára felhasználásuk jelentősen csökkent Természetben egyes növények, állatok termelik, de keletkezhet természetes égési folyamatokban pl. vulkánkitörés, erdőtűz Klórmetán emisszió döntő részét tengeri szervezetek termelik Fluoracetátot, mely nagyon toxikus (gátolja a Krebs ciklus körforgását) egyes magasabb rendű szárazföldi növényekben mégis előfordul Szöcskék klórozott aromás vegyületeket (2,5-diklórfenol, 2,6-diklórfenol) szekretálnak hangyák elriasztására, illetve a nőstény atka/kullancs szexferomonként termeli Emberi szervezetben a pajzsmirigy tiroxin hormonja egy tetrajód-tirozin származék

Halogén tartalmú vegyületek Talajba jutva egy részük megkötődik a talajszemcséken, ami részben akadályozza kimosódásukat, de mikrobiális lebontásukat is Vízben nem vagy nagyon rosszul oldhatók Felhasználásuk szempontjából ez előnyös Ellenáll a mikrobiális lebontásnak Ipari jelentőségükkel ellentétes környezeti hatásuk (előnyös tulajdonságaik a visszájára fordultak) Toxikusak Fő probléma, hogy nehezen hozzáférhetők Eltávolításukra megoldás: detergens alkalmazása a szennyezett talaj kiásása égetés biotechnológia

Bontás biotikus reduktív dehalogénezés oxigenolitikus dehalogénezés hidrolitikus dehalogénezés tiolitikus dehalogénezés dehalogénezés intra- molekuláris szubsztitucióval dehidrodehalogénezés hidrodehalogénezés abiotikus hidrolizis víz jelenlétében, megfelelő körülmények között domináns oxidáció UV sugárzás hat-ra a C-halogén kötés hasad, a gyökök oxigén tartalmú molek-kal reagálnak redukció fémionok jelenlétében, csak laborban ment

Bár úgy tartjuk számon a klórozott vegyületeket, mint ellenálló molekulák, sok mikroorganizmus képes bontani megfelelő körülmények között Reakciók: 1. Reduktív dehalogénezés (elektrondonor jelenlétében) - a C-Cl kötés hidrogénnel v. elektronnal redukálható, miközben szénhidrogén és sósav keletkezik a) hidrogenolizis: b) „szomszéd” redukció v. dihaloelimináció:

2. Oxigenolitikus dehalogénezés - mono-, vagy dioxigenázok katalizálják - hosszúláncú haloalkánok, klórozott aromás vegyületek a) monooxigenáz katalizálta reakció: b) dioxigenáz katalizálta reakció:

3. Hidrolitikus dehalogénezés - a kloridot vízből nyert hidroxil csoportra cseréli - halohidrolázok, főleg alifás vegyületeket (2-8 szénatomos) 4. Tiolitikus dehalogénezés - a reakcióban glutation vesz részt, melynek kén atomja cseréli le a klór atomot, a keltekező tioéter hidroxilálódik

5. Halogénmentesítés intramolekuláris szubsztitucióval - haloalkoholok esetén 6. Dehidrodehalogénezés - csak olyan vegyület esetén lehetséges, ahol a halogén atomot hordozó szénatom melletti szénatomon hidrogén van 7. Hidrodehalogénezés - 3-klórakrilsav - hidratáz enzim katalizálta reakció víz jelenlétében

Halogén tartalmú alifás vegyületek:. peszticidek, oldószerek, stb Halogén tartalmú alifás vegyületek: peszticidek, oldószerek, stb. fő talaj-, talajvíz-, ivóvíz-szennyezők halometánok illékonyak, ózon- rombolók aerob talajbaktériumok – pl. Methylosinus sp.,Methylococcus sp. metán monooxigenáz, ammónium monooxigenáz, hidroláz Példák diklórmetán lebontása aerob metilotrófokkal: Methylobacterium,Methylophilus – glutation függő dehalogenáz tetraklórmetán – oldószer, perzisztens, toxikus, karcinogén hidrolitikus klórelt. + CH3CO-SCoA CO2 + acetát CCl4 hipotetikus út redukció CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl CH4 féléletideje vízben kb 1000 év, atmoszférában 36 év

TCE (triklóretilén) - nem ismert olyan baktérium, mely egyedüli szén-, és energia- forrásként hasznosítja - biodegradáció kometabolizmussal, oxigenáz reakció, szubsztrát lehet: alkán, alkén, aromás - aerob bontás: Metanotrófok, Pseudomonasok A keletk. epoxid instabil, spontán továbbalakul - anaerob körülm. között metanogenezis során acetátot szubsztrátként hasznosító mikroorg. segíts-vel reduktív klórlehasítással 1,2-diklóetilén keletk.

TCE bontása metanotróf baktériumban: Növekedési szubsztrát CH4 CH4 NADH O2 Metán-monooxigenáz H2O NAD+ CH3OH Köztes metabolizmus szaporodás

 Hosszúláncú klórozott alkánok. - plaszticizálóként haszn  Hosszúláncú klórozott alkánok - plaszticizálóként haszn.festékekben, gumiban, műanyagokban - oxidatív reakcióval támadható - széles spektrumú alkán monooxigenáz enzimet szintetizáló baktériummal, melynek érdekessége, hogy a klórozott szubsztráttal indukálható az enzim

Hexaklórciklohexán (HCH) - inszekticid Hexaklórciklohexán (HCH) - inszekticid  HCH = lindán - 3 sztereoizomerek: a, b, g - állati idegrendszerre is hat! - szinte mindenhol betiltott. - bontó szervezetek: Pseudomonas putida Sphingomonas paucimobilis Dehidroklorináz haloalkándehalogenáz

Haloaromások: mint intermedier haszn. finomvegysz. szintézishez Haloaromások: mint intermedier haszn. finomvegysz. szintézishez - többféle aerob lebontási út lehet: a) először a halogén elem távozik, utána hasad a gyűrű b) először hasad a gyűrű - minél több a klór atom a gyűrűn annál valószínűbb az anaerob lebontás, ekkor reduktív delogénezés történik 1. Klórbenzolok, klórfenolok a klóratomok számának emelkedésével csökken a vízoldékonys. illékonyak, lipofilek, toxikusak, akkumulálódnak aerob bontásuk pl. Pseudomonas sp.

2. Poliklórozott bifenilek (PCB) - nagy kémiai stabilitás, alig oldódik vízben, kevésbé illékonyak - óriási mennyiségben gyártották – antimikrobiális ágensek, herbicidek, transzformátor folyadék, kenőanyag, hűtőfolyadék, de papír-, festék-, stb. gyártásban is használták, már betiltották gyártásukat biodegradáció: 1. aerob út, a PCB mint szubsztrát szerepel 2. aerob kometabolizmus, a PCB nem szubsztrátja az enzimnek 3. anaerob reduktív halogén eltávolítás (metanogének, szulfátredukálók) Sphingomonas paucimobilis 2,3-dihidroxi-bifenil dioxigenáz Utóbbi években inkább azt vizsg. hogyan tehetők hozzáférhetőbbé a molekulák (felületaktíva-k, ciklodextrinek, elektrondonorok alk.)

3. Poliklórozott dibenzodioxinok és dibenzofuránok - ált. égetés során keletkező melléktermék - extrém alacsony vízoldhatóság - aerob bontás pl. Sphingomonas sp RW1 dioxin dioxigenáz gombával pl. Phanerochaete sordida Magasabb klórozottsági fokú vegyületek esetén először a klórozottsági fok csökken, majd e fenti reakció megy végbe

Összefoglaló a haloaromás vegyületekről A haloaromás vegyületek, noha csak néhány évtizede jelentek meg a természetben, máris sok bontó/átalakító szervezet található környezetünkben, tehát biológiai úton bonthatók Legtöbb esetben plazmidon kódolt enzimek felelősek a lebontásért Minden esetben hatásos tápanyagok-, és oxigén adagolása Nem minden esetben előnyös ‘külső’ mikroorganizmus hozzáadása Ha a lebontás kometabolizmussal megy szükséges egyéb szervesanyag bejuttatása, ez azonban in situ remediálás esetén nem kívánatos (nem megengedett) Ritkán előfordul, hogy az átalakítás végterméke még toxikusabb

Nitro- funkciós csoportot hordozó vegyületek mikrobiális bontása Természetben előfordulásuk ritka, főleg emberi tevékenység következménye Természetes eredetű vegyületek pl. azomycin, klóramfenikol, pirrolnitrin Nemcsak toxikus, de mutagén, karcinogén hatás is festék-, peszticid-gyártás és robbanóanyag-gyártás hulladékaként jelenik meg A nitrotoluolok a robbanószerek pl. TNT építőelemei Mivel a nitro csoport könnyen átalakítható más funkciós csoporttá, kedvelt intermedier számos kémiai szintézisben, pl. anilin gyártás Parfümgyártásban is használják, egyes vegyületei pézsmaillatot árasztanak

Nitro funkciós csoportot hordozó vegyületek biodegradációja Perzisztenciájuk fő oka nitro funkciós csoportjuk, mely erősen elektronelszívó hatású, emiatt az aromás gyűrű elektronhiányos, így akadályozzák az oxigenolitikus reakciókat (az oxigenázok elektrofil támadása gátolt) bonthatóságukat befolyásoló egyéb tényezők – oldhatóságuk (biol. hozzáférés), szorpció/deszorpciós tul., koncentráció, kémiai természet Mono-, esetleg dinitro vegyületeknél lehetséges oxigenolitikus bontás (mivel a természetesen előforduló vegyületek ált. mononitro vegyületek, így az evolúció során egyes szervezetek képesek voltak adaptálódni, és felhasználni e vegyületeket)

R1-CH(NO2)-R2 + O2 + H2O R1-CO-R2 + HNO2 + H2O2 Nitroalkánok - gombák, streptomycesek bontják - flavoenzimek (FAD prosztetikus csoport) pl. Fusarium oxysporum - nitroalkán oxidáz: R1-CH(NO2)-R2 + O2 + H2O R1-CO-R2 + HNO2 + H2O2 pl. Hansenula mrakii 2-nitropropán dioxigenáz: 2 CH3CH(NO2)CH3 + O2 2 CH3COCH3 + 2 HNO2 Megjegyzés: érdekes, hogy ebben az esetben a dioxigenáz az oxigén molekula két atomját két molekulába építi, ez más dioxigenázokra nem jellemző! 2. Nitrát észterek (C-O-NO2) - természetben nincs, emberi alkotás - pl. glicerol trinitrát = nitroglicerin - bontás: alig van példa, nem specifikus enzimreakciót feltételezünk Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas sp. Enterobacter cloacae

- erősen mérgező anyagok 3. Nitroaromás vegyületek - erősen mérgező anyagok - gyógyszer és festékipar számára nélkülözhetelen kiindulási anyagok - bontásukra négy ismert mechanizmus: a) oxigén jelenlétében nitrit szabadul fel b) kezdeti redukció eredménye aromás amin, ami tovább bont c) nitro csoport teljes reduktiv eliminációja, nitrit szabadul fel d) nitro csop. részleges redukciója hidroxilaminná - pl. Pseudomonas, Nocardia, Ralstonia, Comamonas, Phanerochaete C-, és N forrásként szolgálhatnak, az anaerobok többsége csak aminokká redukálja (-ketoadipát)

TNT reduktív mikrobiális transzformációja Gyengén vízoldékony, toxikus, ellenáll az oxigenolitikus támadásnak Mikrobiális bontására konkrét bizonyíték nincs, de Pseudomonas savastanoi faj TNT denitrációt mutatott, de szaporodást nem tapasztaltak, azaz nem szénforrás anaerob körülm. között pl. szulfát redukálók N forrásként hasznosítják TNT = trinitrotoluol TAT = triaminotoluol nagyon reaktív, oxigén jelenlétében gyors auto- oxidáció és polimerizá- ció tört., valamint erősen kölcsönhat a talaj- komponensekkel, így a mikrobák számára nem hozzáférhető TNT TAT

A TNT és fontosabb metabolitjainak kapcsolata a talajjal (a vastagított szürke nyíl az irreverzibilis szorpciót jelöli, a beszínezett aromás gyűrű azokat a metabolitokat jelöli, melyeket azonosítottak a redukciós folyamatban). Rieger and Knackmuss (1995). talaj

Hipotetikus ábra: a TNT redukciója és kemiszorpciója a talaj szervesanyagaihoz anaerob/aerob kezelés után A TNT redukált metabolitjainak kovalens kötéseit sárgával jelölték, melyeket NMR vizsgálatokkal igazoltak (Lenke és mtsai 2000; Achtnich és mtsai 2000). Anaerob fázis Aerob fázis Kölcsönhatás a talaj mátrix anyagaival Kezdeti szorpció A folyamatos redukció kovalens kötésű származékokat generál Kemoszorpció amin-, amid-, és imin- kötéseken keresztül A szorbeálódott vegyületek a hidrolizis vagy a biológiai oxidáció hatására nem mobilizálódnak újra

TNT szennyezett talaj dekontaminálására fejlesztett eljárás  N2 O2 M 40 hét alatt 2,5 gTNT/kgtalaj konc. kb 95%-kal csökkent Mosó oldat tartály Szennyezett talaj tartály 2 3 3 4 1 Anoxiás bioreaktor Aerob bioreaktor Ülepítő fotoreaktor

Policiklikus aromás szénhidrogének (PAHs) A PAH-ok lipofil vegyületek, a fosszilis energiahordozók nem tökéletes égetésének melléktermékei megtalálhatók a levegőben, talajban, üledékekben, felszíni-, és talajvizekben Vízoldékonyságuk csekély mértékű, viszont szerves oldószerekben jól oldódnak A molekulák oxidációval, redukcióval szembeni ellenállóképessége, és illékonyságuk a molekulatömeg növekedésével együtt nő. Többségük karcinogén Hasznosításuk: főleg intermedier vegyületként a gyógyszeriparban, mezőgazdaságban, fotográfiában, hőre keményedő műanyagok, kenőanyagok előállításában, a vegyiparban Kinyerése kőszénkátrány feldolgozás során, illetve kőolaj finomítási folyamatokból származó olajmaradékokból

PAH-ok szerkezeti formái, vízoldékonyságuk, karcinogenitásuk PAH-ok sorsa a környezetben Bioremediáció Metabolitok Adszorpció a talaj szervesanyagaihoz Bioakkumuláció Kémiai oxidáció Volatilizáció Fotooxidáció Mineralizáció Eltávolítás vagy detoxifikáció

Eltávolításuk a környezetből Nem biológiai jellegű eltávolításuk: volatilizáció, fotooxidáció, kémiai oxidáció, adszorpció Mikrobiális lebontásuk gátolt a gyenge biohozzáférhetőség miatt, ami elsősorban csekély mértékű vízoldékonyságuknak köszönhető Gram-, Gram+ baktériumok: Pseudomonasok, Sphingomonasok, Acinetobacterek, Alcaligenesek, Rhodococcusok, Mycobacteriumok…; gombák: Phanerochaete chrysosporium, Cunninghamella elegans…; algák: cianobaktériumok

PAH-ok mikrobiális lebontásának kezdeti oxidációs reakciói

PAH-ok anaerob biodegradációja Oxigénhiányos környezetben, denitrifikáló körülmények között bizonyított pl. a naftalin bontása Érdekes, hogy kevert PAH szubsztrátok esetén jobb hatékonyságú a biodegradáció, mint egyedi szubsztrát esetén A különböző redukáló körülményeket összehasonlítva, a legnagyobb mértékű degradáció szulfát redukáló körülmények között figyelhető meg, majd metanogén környezetben, és végül nitrát redukáló feltételek mellett