2D gélelektroforézis a proteomikában

A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME” (Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Térben és időben dinamikusan változik A proteomika a proteomok jellemzésével foglalkozó tudományág.

Új információk nyerhetőek a különböző állapotú sejtek, organizmusok fehérjekészletének összehasonlításával. - stressztoleranciáért felelős fehérjék - virulenciáért felelős fehérjék - rezisztenciáért felelős fehérjék - betegségek kialakulásáért felelős fehérjék - transzkripciós faktorok célgénjeinek terméke Vizsgálata: Két-dimenziós gélelektroforézis + tömegspektrometria Kvantitatív tömegspektrometria

Miért 2D gél? A proteomok nagyon komplexek (ember:~200.000 fehérje), ezért szükség van egy elválasztási technikára ami: reprodukálható nagy felbontású (1D-kb. 100 fehérjesáv, 2D kb. 10 000 spot) megengedi a minták kvantitatív összehasonlítását megengedi a poszt-transzlációs módosítások detektálását

Mi az a 2D gél? Az első és második dimenziós elválasztás különböző „molekuláris tulajdonság” alapján történik: Első dimenzió = izoelektromos pont - izoelektromos fókuszálás Második dimenzió = molekula tömeg - SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gélelektroforézis)

Izoelektromos fókuszálás Festés és vizualizáció SDS PAGE Mintaelőkészítés Fehérjék azonosítása MS Festés és vizualizáció Spotok kivágása Gélképek analízise

Mintapuffer denaturáló szerek nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek A legtöbb mintapuffer a következő összetevőket tartalmazza: denaturáló szerek nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek redukáló szerek carrier amfolitok brómfenolkék

Izoelektromos fókuszálás Mintaelőkészítés

Izoelektromos fókuszálás pH 3 pH 10 A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően Izoelektromos pont: ezen a pH érteken a fehérje töltése nulla

Strip-ek Egy kis történelem…… Patrick O’Farrell: 1975, J Biol Chem 250, 4007-21 gél rúd „mobil” pH gradiens rossz ismételhetőség nehéz kezelhetőség Az első

Még mindig nehezen kezelhető 1982, J.B.B.M. 6: 317-339 Rögzített pH gradiens Még mindig nehezen kezelhető 1988, Electrophoresis, vol 9, p 531 A gél fóliára rögzítése Könnyen kezelhető Reprodukálható Pier Giorgio Righetti

Strip-ek A pH gradienst tartalmazó nagyon lágy (4%) gél egy vékony fóliához van polimerizálva és rászárítva Sokféle pH gradiens (Pl.: 3-10, 4-7, 5-8, 9-11) Számos méret (7, 11, 17, 18, 24 cm) Néhány cégnél lehet a szokásostól eltérő pH tartományú, hosszúságú strip-et rendelni

Izoelektromos fókuszálás Tálcákban történik A stripek olajjal vannak lefedve Limitált áramerősség mellett (50 µA) Magas feszültség mellett (10 000 V, 17 cm-es stripnél) 20 OC-on Általában optimalizálni kell a futtatási időt

Izoelektromos fókuszálás SDS PAGE Mintaelőkészítés

SDS-PAGE A fehérjéket „beburkoljuk” SDS-el (anionos detergens) ezáltal egységesen negatív töltést kapnak A fehérjék az anód felé törekszenek, ha elektromos mezőbe helyezzük őket A fehérjék mozgása a gélben csak a relatív molekula-tömegüktől és az alkalmazott gél pórusátmérőjétől függ

Strip ekvilibrálás Az elsődleges cél, hogy a fehérjéket SDS-el beburkoljuk Egyéb célok: a strip teljes hosszában egységessé tenni a pH-t (1,5 M Tris puffer, pH 8.8) redukálni (újra) és alkilálni a cisztein oldalláncokat, ezért két lépcsőben történik az ekvilibrálás: redukálás DTT-vel, a visszaalakult kén hidak megszüntetése a cél

alkilálás jódecetsavval, a redukált cisztein oldalláncok végleges módosítása a cél, de a maradék DTT/DTE is elreagál a jódecetsavval, ezért a redukáló szerekhez képest 3-10-szeres mennyiségben alkalmazzuk. Az elektro-ozmózis elkerülése miatt a stripeket 20-30% glicerinnel is átitatjuk

SDS-PAGE A leggyakrabban használt technikák Laemmli 1970-ben publikált technikájára épülnek két fontos különbséggel: A ‘stacking’ gélt kiváltja a strip, mivel annyira lágy gél, hogy tökéletesen képes azt pótolni A stripet a szeparáló gél tetejére kell ragasztani felolvasztott agaróz segítségével

Izoelektromos fókuszálás Festés és vizualizáció SDS PAGE Mintaelőkészítés Festés és vizualizáció Gélképek analízise

Gél festése Többféle festési eljárás létezik A három leggyakrabban alkalmazott Ezüstfestés: nagyon érzékeny, de nem végpontos, ezért nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra Coomassie festés: kevésbé érzékeny, mennyiségi összehasonlításra alkalmas Fluoreszcens festések (pl.: SyproRuby): nagyon érzékenyek, kvantitatív festés, de detektálásuk drága berendezést igényel

RuBPS Sypro Ruby BioSafe Coomassie Silver

Gél analízis Számítógépes programok segítségével PDQuest, Melanie, Dimension, Phoretix 2D Automatikus spot detektálás és matching A spot kiterjedését és intenzitását veszik figyelembe a mennyiségi analízisnél

Hasznos linkek http://www.weihenstephan.de/blm/deg/manual/manualwork2html02test.htm http://www.expressionproteomics.com http://www.bspr.org/Society_links.html http://www. proteomicsnetwork.de/ http://www4.amershambiosciences.com/APTRIX/upp01077.nsf/Content/literature_discussion_groups