Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna FÉMOXIDOK: SiO 2, Al 2 O 3, CaO, MgO, BaO, TiO 2, CeO 2, ZrO 2, SÓK: SZILIKÁTOK, Mg-Al szilikátok és egyéb összetett vegyületek (Florisil, földpátok, bentonit, kaolin, síkpor, agyag) KARBONÁTOK, SZULFÁTOK (Ca-Mg-karbonát, Ca-szulfát), FOSZFÁTOK (Ca-, Zr-, HIDROXI APATIT) NITRIDEK – BN PORÓZUS ÜVEG SZEMCSÉK (Controlled Pore Glass, CPG μm) CPG GLYCOPHASE (gliceropropilszilán réteggel) SZERVETLEN (SZILIKA) – SZERVES (POLIMEREK) KEVERT TÍPUSOK A folyadékkromatográfiás állófázisok - szervetlen

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna SZÉN (aktív C, porózus grafitált karbon, PGC) POLISZACCHARIDOK (cellulóz, keményítő, porcukor) DEXTRÁN (keresztkötésekkel térhálósított gélek, Sephadex) AGARÓZ (agar-agar, agaropektin) POLIAMID POLIAKRILAMID (akrilamid - metilén bis-akrilamid kopolimer) POLIETILÉN IMINEK A folyadékkromatográfiás állófázisok - szerves

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szilika alapú állófázisok Silica SolsXerogels Spherical Irregular

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Monolit oszlopok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázisokkal szemben támasztott követelmények Stabilitás (nyomás, hő, pH, oldékonyság, bakteriális, kémiai…) Minél kisebb és homogénebb szemcseátmérő (hatékonyság és nyomásesés) Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása);

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Állófázisok jellemzése  Állófázisok jellemzése: Az átlagos pórus átmérő A fajlagos felület A fajlagos pórustérfogat Pórus átmérő gyakoriság (%) dp (nm) Ideális eloszlás dp átlag  Ne legyen pórusgátlás ( Feltétele hogy a molekula mérete egy nagyságrenddel kisebb legyen mint pórusátmérő) Ideális esetKésőn jön ki (tailing)Beszorul (tailing)

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A szilikagél felülete Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) OH Si O OH Si O Izolált szilanol csoportok O Si O O O Vicinális szilanol csoportok HH O Si O O O H H O HH Dezaktivált szilanol csoportok Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) OH Si OO O OH Si O O OH Si O O OH Si O O Szilárd fázis Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Problémák: Kelát képzés Reaktív/savanyúbb szilanol csoportok Fémszennyezések hatása Legproblémásabb szennyezők: Fe(III), Al (III)

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Si CH 3 Si O CH 3 CH 2 NH2NH2 Árnyékoló TávtartóKölcsönható CN NO2NO2 CH(OH)-CH 2 (OH) Módosított szilika állófázisok ….. C 18

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C 6 H 5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH 2 (amino) - i-propil - N(CH 3 ) 2 (dimetil amino) - i-butil Módosított szilika állófázisok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Sterically Protected (non-endcapped) Classic ODS Conventional (non-endcapped) Conventional (endcapped) * Savasan hidrolizálhat Módosított szilika állófázisok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH 2, CN, NO 2, diol stb.). Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására.

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező (minél nagyobb a kötödés, annál nagyobb a visszatartás): a vegyület leszorítja az oldószer molekulákat a szilárd fázis felületéről;  Oldószer víztartalma (H-hidas kötésekkel megakadályozza a vegyületek megkötődését, víztelenítés vízmentes különböző polaritású oldószerekkel vagy N 2 -el szárítás 150  C-on;  Pórusok átmérője;  Szilanol csoportok típusa;  Fémszennyezők jelenléte (polarizálja a szilanol csoportot), a harmadik generációs szilikagélekre a fémtartalom < ppm). Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia  Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt (általában bázikus vegyületeknél);  Gyengébb adszorpciós kölcsönhatást mutat;  Olyan vegyületek vizsgálatára, amelyek savkatalízisre bomlanak;  Alakszelektivitást szeretnénk elérni;  Szilikagéltől eltérő szelektivitás. Aluminium-oxid (pH = 2 – 12 ) u (cm/sec) H általában Al 2 O 3 Mert jobb a pórusszerkezet Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt; Víz dezaktiváló hatás csökkentése; Szelektivitás növelése; A mozgófázis polaritásától függően lehetnek fordított fázisú töltetek!!! Módosított szilikagél (pH = 2 – 8 )

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgófázisok (eluens)  Apolárisabb az állófázisnál  Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel  Detektor kompatibilitás  Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O 2 mentes stb.)  Alacsony viszkozitású (  < 1 cP 25  C-on)  Könnyen beszerezhető, elfogadható áron  Biztonságos (CCl 4 benzol stb. egészségre káros)  Könnyen keveredő  Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt) Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Alap oldószerek:  Hexán  Heptán  Izooktán Oldhatóság, polaritás növelő oldószerek:  Diklórmetán  Diklóretán  Kloroform (stabilizálás etanollal !!!) Modifikátorok:  Módosító szerek az állófázis felületét megváltoztatják (csökkentik a retenciót);  Fém szennyeződések maszkírozására ecetsavat  Vizet és aminokat nem használunk – irreverzibilisen kötődnek Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP)

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis  Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 2  8); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 1  14); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a) ;

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szerves polimer alapú állófázisok -A teljes pH tartományban alkalmazhatóak; -Térhálós szerkezetűknek tulajdoníthatóan nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek; -Mikropórusok képződése elkerülhetetlen, így kinetikai hatékonyságuk kisebb mint a szilikagél alapú állófázisoké. SztirolDivinil-benzolKopolimer Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Szerves polimer alapú állófázisok -A szerves polimert oldó oldószerek (klórozottak) duzzasztják a polimert, ettől összeroppan -Apoláris jelleg csökkentésére módosítják a polimert (pl. szulfonil, piridin stb.) Polaritást növelő módosítások Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Eluenserősség Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Elúciós erő Szelektivitás Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 26 Az eluensek legfőbb tulajdonságai Tisztaság Viszkozitás Refraktív index Forráspont Toxicitás UV-Cutoff Oldhatóság/elegyíthetőség/oldóképesség

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 27 Solvent Miscibility

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Semleges  A pH nem befolyásolja a molekula állapotát, ezért NINCS szükség a pH ellenőrzésére.  Semleges vegyületek: Polikondenzált aromások;Polikondenzált aromások; Halogénezett aromás vegyületek;Halogénezett aromás vegyületek; Alkoholok;Alkoholok; Éterek;Éterek; Ketonok;Ketonok; AldehidekAldehidek Stb.Stb. Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek  A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-COOH  R-COO - + H + Ionizált forma (polárisabb-vízoldható ) Nemionizált forma (apolárisabb) Sosem kromatografálunk pH = pKa értéken !!! LeChatelier elv Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH k pKa Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pKa-2pKa+2 Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek  A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-NH 2 + H +  R-NH 3 + Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) Nemionizált forma (apolárisabb) pH k pKb Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pK b -2 pK b +2 Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH kontroll pufferek segítségével történik (csak szükség esetén használjuk, mert csökkentik az állófázis élettartamát!)  Puffer koncentrációja (2mM-0,2M tartományban)  Gyakran használt pufferek:  Foszfát  Citrát  Trisz(hidroximetil)-aminometán  Acetát  Formiát  Stb. Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények:  A  A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz;  Szilárd  Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!);  Adott  Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése;  Puffer  Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb);  A  A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben;  Puffer  Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel); Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 35 Praktikus tanácsok a HPLC-s oszlopokkal kapcsolatban  Avoid any physical stress to the column  Close on both ends to avoid dryness  Store the column well flushed with the appropriate solvent  Record the history of the column

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna 36 Column Installation Each column has a defined flow direction! The flow direction is shown by the arrow or direction of writing. Don’t change the flow direction, this will decrease column performance.

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Column Care and Handling Wash the column after use with selected solvents; flush highly retained sample components from the column. Do not store a column in 100% water. Microbes may grow and clog the column. Don’t open the column and repack the material if you want to maintain performance. Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rates. Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high temperature. Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column.

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Detektorok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna A detektorok legfőbb jellemzői Destruktív – nem destruktív Szelektív – univerzális Érzékenység Linearitási tartományDinamikus tartomány

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Komponensek tulajdonságát észlelik  UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS)  Fluoreszcenciás detektor (FLD)  Elektrokémiai detektor (ECD)  Radiokémiai detektor (RD)  Tömeg detektorok (MSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax) A folyadékkromatográfiás detektorok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Mozgófázis tulajdonságát észlelik  Törésmutató detektor (RID)  Vezetőképesség detektor (CD)  Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység A folyadékkromatográfiás detektorok

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor Alapelv: Lambert-Beer törvény

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Chromophore Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl - NH - C = C - C = O - COOR - CHO - COOH - NO , , 275 max(nm) Structure UV-VIS detektor

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV spektrum  Kromatográfiás elválasztás;  Minél magas hullámhossz annál szelektívebb  max pH függése  oldószerek, adalékok UV elnyelése Hullámhossz (nm) Abszorbancia (mAU) Benzamidofenol Paracetamol 280 nm

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV Cutoff SolventUV Cutoff (nm) Acetonitrile190 Water190 Cyclohexane195 Hexane200 Methanol210 Ethanol210 Diethyl Ether220 Dichloromethane220 Chloroform240 Carbon Tet265 Tetrahydrofuran280 (220) Toluene285 UV cutoff is the wavelength at which absorbance equals 1, measured in a 1 cm cell with air as a reference.

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna VWD – Variable Wavelenght detector Átfolyó cella Diffrakciós rács tükör tükör Mintafotodióda tükör tükör deutérium lámpa Fénynyaláb osztó A diffrakciós rács monokromatikus fényt állít elő A monokromatikus fényt megosztjuk a referencia és minta fotodióda között Az intenzitásbeli különbséget a cellában történő abszorbancia okozza lencse

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector Diode Array Grating Optical Slit Detector Flow Cell Homium Filter Achromatic Lens UV Lamp Vis Lamp

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Deutérium lámpa tesztje

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna On-line spektrum Wavelength Time Absorbance Spectra

Elválasztástechnika2011Eke Zsuzsanna Csúcstisztaság Spectral differences at different points of peak elution Peak with time marker for spectra selection