A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor
Bevezetés Restrikciós enzimek / restrikciós térképek Genom könyvtárak Fehérje aminosavsorrend meghatározás Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) Direkt szekvenálás Egyféle termék Klónozott PCR termék Többféle termék Egymásra rakódó szekvenciák Klónozás plazmidba
Módszerek Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció 5’ radioaktív izotópos jelölés (32P) Bázis specifikus hasító reakciók Elektroforézis, autoradiogramm Mérgező anyagok, négy reakció Sanger-féle enzimatikus módszer Automatizálható!!!!! Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb mennyiségű is kimutatható Egy reakcióban is megoldható Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben
A reakcióelegy: Templát Oligonukleotid primer DNS polimeráz Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
A szekvenálás Denaturáció Anelláció Elongáció Egy primer Elongáció Véletlenszerű lánc termináció
A szekvenálás menete
Elválasztás Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm) Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség → nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira Kis feszültség: szebb elválasztás Poliakrilamid mátrix Betöltés: nagynyomású nitrogén nagy felbontás Minta bejuttatása Elektrokinetikus injektálás Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak! Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség
Detektálás A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát Fluoreszcensen jelölt primer Négy reakció Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid Négy futtatás Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok Egy reakció Egy futtatás Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható
Kiértékelés A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik. Szekvencia ellenőrzés!!!!! Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi Kiértékelési hibák Kimaradt betűk
Szekvenciák összehasonlítása Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és összehasonlítani az eredményeket. Összehasonlításhoz ingyenes internetes szoftverek. (Clustal, Multalin)
TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)
Irodalomjegyzék Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )
Köszönöm a figyelmet!