A növényvédelemben alkalmazható gyógynövény illóolajok és főkomponenseiknek ciklodextrin komplexei Oláh Eszter, V. évf. Vegyész ELTE TTK Szerves Kémia Tanszék Témavezető: Dr. Orgoványi Judit

Növényvédelem → szelíd növényvédelem vegyszeres kezelés → környezetünket megterheli ↓ környezetbarát növényvédőszer formulációk Illóolajok és illóolaj főkomponensek: ─ rovarriasztó, gombaölő és antibakteriális hatás ─ illékonyság, levegőre és hőre való érzékenység → korlátozott növényvédelmi felhasználás Cél: stabil forma kialakítás ciklodextrin-vendégmolekula zárványkomplexek képzésével illóolajok és főbb komponensek kölcsönhatása különböző ciklodextrin származékokkal → permetezőszer → por alakú növényvédőszer A növényvédelemben ma a legelterjedtebb és leghatásosabb módszer a vegyszeres kezelés, amely a környezetünket jelentősen megterheli. Emiatt arra törekedtem, hogy minél inkább környezetbarát, egészségre kevésbé ártalmas növényvédőszer formulációkat állítsak elő, és ezzel megvalósítsam a növényvédelem „szelíd” formáját. Egyik ilyen lehetőség illóolajok, illetve illóolaj főkomponensek alkalmazása, melyek rovarriasztó, gombaölő és antibakteriális hatása már régóta ismeretes. Illékonyságuk, levegőre és hőre való érzékenységük miatt azonban a növényvédelemben való használhatóságuk mindeddig korlátozottnak tűnt. Ezért célul tűztem ki, hogy a stabil formát ciklodextrin-vendégmolekula zárványkomplexképzéssel alakítsam ki, és hogy a kiválasztott illóolajok és a főbb komponensek különböző ciklodextrin származékokkal való kölcsönhatása alapján végül permetezőszert és por alakú növényvédőszer formulációt hozzak létre.

Vizsgált illóolajok és főkomponensek Gyógynövény illóolajok borsmentaolaj citromfűolaj kakukkfűolaj levendulaolaj Főbb komponensek mentol, menton citrál, citronellal timol, karvakrol, borneol linalool, borneol Szerkezeti képletek borneol fehér kristályok antibakteriális, antioxidáns és rovarkártevők elleni hatás mentol rovarriasztó és gombaellenes hatás timol antibakteriális, lárvaölő és rovarriasztó hatás citrál sárga folyadék rovarriasztó hatása miatt kártevők elleni védekezés linalool rovarriasztó és antimikróbás hatás Az illóolajok általában több száz komponensből álló keverékek. Tulajdonságaikat a főkomponens tulajdonságai döntő mértékben befolyásolja. Kutatásaim során a borsmenta-, citromfű-, kakukkfű- és a levendula olaját és ezek kék színnel kiemelt főkomponenseit (a borneolt, a mentolt, a timolt, a citrált és a linaloolt) vizsgáltam. A szerkezeti képleteik, a tulajdonságaik és a növényvédelmi alkalmazhatóságuk a felsorolásban szerepelnek.

Ciklodextrinek szerkezete és tulajdonságai gyűrű alakú, nem redukáló oligoszacharidok hidrofil / hidrofób rész → apoláris vendégmolekula komplexbe zárása CD Glu α → 6 β → 7 γ → 8 A ciklodextrinek gyűrű alakú, nem redukáló oligoszacharidok, amelyek 6, 7 vagy 8 db C-1 konformációjú glükopiranóz egységből állnak. A gyűrű külső kék színnel jelölt hidrofil része szabad primer és szekunder hidroxil-csoportokat tartalmaz. A sárga színnel jelölt hidrofób belső részt hidrogén atomok és glükozidos oxigén-hidak alkotják. Ez a speciális szerkezet teszi lehetővé, hogy különböző apoláris vendégmolekulákkal – álatlában stabil - zárványkomplex képződés menjen végbe.

β – ciklodextrin származékok HPBCD (DS~3) -OH ill. -O-CH2-CH(OH)-CH3 -OH RAMEB (DS~12) -OH ill. -O-CH3 SU-RAMEB DSSU ~ 1-2 DSMe ~ 12 -OH, -O-CH3 ill. -O-CO-(CH2)2-COOH MA-RAMEB DSMA ~ 1-2 DSMe ~ 9 -NH3Cl (1db), -OH ill. -O-CH3 Az alap ciklodextrin C2-es és C3-as szekunder illetve C6-os primer hidroxil-csoportjának módosításával különböző tulajdonságú származékok állíthatók elő. Munkám során a BCD származékaival a hidroxi-propil-BCD, random metilezett-BCD, szukcinil- és monoamino- random metilezett-BCD származékkal dolgoztam. Ezek szerkezetét foglaltam össze a táblázatban. A HPBCD és a RAMEB iparilag nagy mennyiségben gyártott termékek, míg a SU- és a MA-RAMEB laboratóriumi kísérletek alatt álló legújabb generációs származékok. (BCD = β - ciklodextrin) DS = szubsztitúciós fok

A ciklodextrinek zárványkomplex képzése dinamikus egyensúlyra vezető folyamat csak fizikai erők tartják össze (Van der Waals) Előnyei és következményei illékonyság csökkenés ellenállóvá válik a levegő oxigénjével és a fény károsító hatásával szemben Vizes oldatban oldhatóság növekedés Szilárd állapotban folyékony és gáz halmazállapotú anyagokból por alak nyerhető víz hatására kontrollált hatóanyag kioldódás A ciklodextrinek zárványkomplex képzése dinamikus egyensúlyra vezető folyamat. A kialakuló komplexet csak fizikai erők tartják össze. A folyamat előnye, hogy a zárványkomplex-képzés során a hatóanyag illékonysága csökken és ellenállóvá válik a levegő oxigénjével és a fény károsító hatásával szemben. Vizes oldatban oldhatóság növekedést tapasztalunk. Folyékony vagy gáz halmazállapotú anyagokból por alak nyerhető. Víz hatására kontrollált hatóanyag kioldódás és hatékonyabb felszívódás érhető el.

Kísérleti rész 1. Oldhatósági izotermák felvétele borneol, citrál, linalool, mentol és timol oldhatósági izotermái szobahőmérsékleten (T = 26°C) öt féle ciklodextrin (BCD, RAMEB, MA–RAMEB, SU–RAMEB és HPBCD) vizes oldataiban kevertetési idő optimalizálása 2. Zárványkomplexek előállítása 19 db komplex közös oldatból liofilizálással, szuszpenziós- és gyúrásos módszerrel 1:1 mólarányú komplexek a víztartalmak figyelembevételével 3. A ciklodextrin komplexek analitikai vizsgálata hatóanyag-tartalom: UV-VIS spektrofotométer és GC víztartalom: Karl-Fischer titrálás termogravimetriás analízis vízben való oldhatóság kioldódási vizsgálatok hőstabilitás – tárolási kísérletek Munkám kísérleti része 3 részre tagolható. Az oldhatósági izotermákat az 5 főkomponens 5 féle ciklodextrin vizes oldataiban vettem fel. A koncentrációkat UV fotometriával és gázkromatográfiával mértem meg. 19 db zárványkomplexet állítottam elő közös oldatból liofilizálással, szuszpenziós- és gyúrásos technikával. A komplexek hatóanyag-tartalmának meghatározásra UV-VIS spektrofotométert és GC-t alkalmaztam. A szilárd minták víztartalmát Karl-Fischer titrálással határoztam meg. Elvégeztem a komplexek termogravimetriás analízisét, vízben való oldhatósági és kioldódási vizsgálatát illetve a hőstabilitáson alapuló tárolási kísérletét.

Eredmények 1. Oldhatósági izotermák A komplexképzési állandók számításának képlete 1:1 mólarányú komplexek esetén: Az eredményeimet az előbb említett tematika szerint mutatom be. Az 5 főkomponens oldhatósági izotermái közül itt csak a borneol ábráját emelem ki. Az izotermák többsége lineáris. A timol kivételével általában a legnagyobb oldhatóság növekedést a SU-RAMEB és a legkisebbet a BCD hozzáadása okozta. A közepes mértékű hatása a RAMEB-nek, a MA-RAMEB-nek és a HPBCD-nek volt. A táblázatban az oldhatósági izotermákra illesztett egyenesek paramétereiből számított komplexképzési állandók értékeit tűntettem fel. Ezek közül nem számíthatóak az izoterma lineáristól való eltérése miatt a zölddel jelölt és az 1-nél nagyobb meredekségű egyenesek lilával kiemelt értékei. Kiugróan magas komplexképzési állandója a citrálnak volt RAMEB oldatban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a ciklodextrinek hatására jelentősen megnőtt a illóolaj-hatóanyagok oldhatósága vízben.

Eredmények 2. Zárványkomplexek jellemzése ← mentol ← citrál ← timol ← linalool A zárványkomplexeket hatóanyag-, és víztartalom illetve a vízoldhatóság szempontjából is vizsgáltam. A hatóanyag-tartalmat az UV-aktívitással rendelkező borneol, citrál, és a timol esetén általában spektrofotométerrel mértem meg, míg az UV-tartományban nem mérhető linallool, mentol és illóolaj komplexeket gázkromatográfiásan analizáltam. Az illóolajokban a megfelelő főkomponens-tartalmat mértem. A főkomponens komplexek 10-16%, az illóolaj komplexek jóval alacsonyabb 0,5-5% hatóanyagot tartalmaztak. Mind közül a legmagasabb értéket a linalool mutatta mindkét komplex esetében. A víztartalom a BCD-s komplexeknél 10-15 %-nyi, míg a RAMEB-bel készült komplexek 1-4 %-nyi volt. A vízoldhatósági értékek alapján kitűnik, hogy a BCD komplexek oldhatósága 3-4 nagyságrenddel kisebb, mint a RAMEB komplexeké. ← mentol ← citrál ← timol ← linalool

Eredmények 3.a Termoanalitikai mérés Főkomponensek és ciklodextrinek külön Mérési paraméterek szobahőmérséklettől (T = 28°C) 250°C-ig, 5°C/perc felfűtési sebesség, 5 m3/h sebességgel áramló N2 atmoszféra, a minták 10-20 mg-jai Al2O3 nyitott tégelyben, referenciaanyag: kiizzított Al2O3 por borneol Elvégeztem a főkomponensek, az illóolajok, a tiszta ciklodextrinek és a 19 komplex termogravimetriás mérését. Az 5 főkomponens közül ismét csak a borneol ábráját mutatom be. Kék színnel a TG, lila színnel pedig a DTG görbék szerepelnek. Valamennyi hatóanyag 120 – 160°C közötti tartományban tömegének 90 – 100%-át elveszítette. A ciklodextrinek termoanalitikai görbéin 30 – 110 °C közötti tartományban vízvesztési csúcs volt látható. Ez a csúcs a vendégmolekulát nem tartalmazó CD víztartalmát mutatja. BCD RAMEB

Eredmények 3.a Termoanalitikai mérés Főkomponens - ciklodextrin zárványkomplexek borneol / BCD borneol / RAMEB A komplexek TG és DTG görbéi három főbb szakaszra bonthatók. Az első szakasz a 30 – 110°C tartomány, amelyben vízvesztési csúcsokat láthatunk a görbéken. A második tartományban 130 – 180°C között a felületen tapadt hatóanyag távozik. Az utolsóra pedig a 250°C feletti hőmérsékleten a komplexben kötött hatóanyag-tartalom vesztés és a ciklodextrin bomlása jellemző. Méréseim során ezt a hőmérsékletét nem léptem át, így ez az átalakulás nem látszik a görbéimen. A komplexbe zárt főkomponensek termoanalitikai jellemzését szintén a borneol példáján folytatom. A BCD-s komplexek többségénél a nem jelent meg a felületen tapadt hatóanyag anyagveszteségi lépcsője, míg ez az átalakulás a RAMEB-es komplexek mindegyikénél jellemző volt. Ez azt jelenti, hogy a komplexált hatóanyag mellett felületre tapadt hatóanyagot is tartalmazott. Itt fontos megjegyezni, hogy a ciklodextrin kémiában nagyon lényeges a ténylegesen komplexben kötött hatóanyag-tartalom meghatározása, ennek mennyiségi mérése csak termoanalitikai módszerrel lehetséges.

Eredmények 3.a Termoanalitikai mérés Illóolaj-ciklodextrin zárványkomplexek Az ábrán az összes illóolaj komplex TG és DTG görbéit mutatom be. A kinagyított ábrán jól látható, hogy 28-250°C-ig végeztem a méréseket a tömegcsökkenés függvényében. Az első sorban a BCD-, a másodikban a RAMEB- komplexek és a harmadikban a tiszta illóolajok ábráit helyeztem el.

Eredmények 3.b Termoanalitikai eredmények ← mentol ← citrál ← timol ← linalool A termikus vizsgálatok során a felületen kötött hatóanyag-tartalmak mennyiségeire is következtettem. Teljesen komplexált terméket csak a BCD gazdamolekulába zárt mentol-, timol-, és borneol- illetve az összes illóolaj mintáknál kaptam. A citrál, linalool BCD-vel nem adtak 100%-os komplexet, mivel 3-5%-nyi hatóanyag volt a felületükön. A RAMEB-es komplexek mindegyikénél 1-6 %-nyi felületen kötött hatóanyagot mértem. Megállapítottam, hogy a komplexképzés tehát a BCD komplexek esetén volt a legkedvezőbb. A sikeres, körülbelül 1:1 mólarányú komplexeket piros színnel emeltem ki. Az illóolajoknál természetesen ez az arány nem is lehet 1:1, mivel jóval kevesebb a főkomponens-tartalmuk. ← mentol ← citrál ← timol ← linalool

Eredmények 4. Kioldódási vizsgálatok Saját módszer HPLC-re: szilárd komplex + víz → 600 perces mintavétel → szűrés (0,45 µm) → injektálás HPLC-vel hatóanyag-tartalom mérés: • chromspher C8-as fordított fázisú oszlop • izopropanol : víz = 25 : 75; 0,6 cm3/perc • Linear 204 UV-VIS detektor Eredmény: citrál-A és citrál-B kromatográfiás elválasztása A kioldódási vizsgálataimat a borneol, citrál és timol BCD komplexeivel végeztem el. A komplexekből a vízbe kioldódott hatóanyag mennyiséget HPLC-re általam kidolgozott saját módszerrel követtem. Ezzel a módszerrel sikerült a citrál-A és a citrál-B izomereket egymástól illetve a borneoltól és a timoltól kromatográfiásan elválasztanom. Az ábrán látható, hogy már az első 30 percben jelentős kioldódás tapasztalható valamennyi komplexnél. A minták közül a legmagasabb kioldódott hatóanyag koncentrációt a gyúrásos technikával készített borneol mutatta. Az átlagos koncentráció 90 perc alatt állt be a 110 – 120 mg/dm3 értékre. Ezt követte a timol és a borneol közel hasonló értékeket mutató szuszpenziós eljárással előállított komplexe. Ezen 3 komplex folyamatosan növekvő telítési görbe szerint állt be a komplex oldhatóságának megfelelő értékre. A legkisebb kioldódása a citrál komplexnek volt, amely a jobboldali kinagyított ábrán látható. A citránál a kezdeti igen magas koncentrációnövekedés miatt túltelített oldat keletkezett. További kevertetéssel az oldatból mikrokristályok váltak ki, ezért csökkent a koncentráció, majd végül ez is a komplex oldhatóságának megfelelő értékre állt be. Ez a kioldódási görbe típus a CD komplexeknél igen gyakori.

Eredmények 5.a Hőstabilitás – tárolási kísérletek 19 komplex → 23 napig 50°C-os szárítószekrényben tárolás hatóanyag-tartalom meghatározás: HPLC, UV/VIS spektrofotométer, GC Példák főkomponens: illóolaj: linalool levendulaolaj Illékony vegyületek hőstabilitásának növelésére gyakran alkalmazzák a ciklodextrineket és származékaikat. Ezen zárványkomplexek szabadtéri alkalmazásának szimulálása céljából a 19 zárványkomplexet hőstabilitási vizsgálatnak vetettem alá. A mintákat 23 napig 50°C-on szárítószekrényben tároltam. Példaként az ábrákon itt csak a linalool és a levendulaolaj komplex hatóanyag-tartalom leadását mutatom be. Jól látható, hogy a komplexek hatóanyag-tartalma a tárolás során alig változott.

Eredmények 5.b Hőstabilitás – tárolási kísérletek A tárolási kísérletek görbéinek adatait ebben a táblázatban foglaltam össze. A táblázat első oszlopában a hőkezelés előtti-, a másodikban a 23 napig 50°C-on tárolt minták hatóanyag-tartalma látható. A harmadik oszlopban a 23 nap után megmaradt hatóanyag-tartalmakat foglaltam össze a kiindulási értékeket véve 100%-nak. A főkomponensek közül a piros színnel kiemelt borneol- és a mentol- komplex tartotta meg ezen körülmények között a leginkább a hatóanyag-tartalmát. Az illóolajoknál is hasonlóan jó eredményeket kaptam. Az alacsony hatóanyag-tartalom okozta nagyobb relatív hibák miatt ezek közül nem emeltem ki külön egyet sem. Eredményeimet tekintve tehát elmondható, hogy a vizsgált szilárd komplexek szabadtéri alkalmazás során is nagy valószínűséggel megállnák a helyüket, mivel egy hónap alatt 70-100%-ban megőrizték az eredeti növényvédő hatóanyag-tartalmukat.

Összefoglalás oldhatósági kísérletek: 5 főkomponens és 5 ciklodextrin kölcsönhatása → oldhatóság növelő hatás: alap BCD < származékok → komplex asszociációs állandók számítása 5 főkomponens 2 különböző ciklodextrin + 19 komplex 4 illóolaj hatóanyag-tartalom: főkomponens → 9-15% illóolaj → 2-4% víztartalom: BCD → 10-15% RAMEB → 1-4% Összefoglalásként elmondhatom, hogy 5 féle főkomonens 5 féle ciklodextrinnel való kölcsönhatását vizsgáltam. Az illóolajok főkomponenseinek oldhatóságára az alap BCD-nek kisebb mértékű, míg származékainak nagyobb mértékű növelő hatása volt. Kiszámítottam a komplexek asszociációs állandóit. 3 különböző komplexképzési módszerrel elkészítettem 5 főkomponens és 4 illóolaj 2 féle ciklodextrinnel alkotott összesen 19 komplexét. Megmértem a komplexek hatóanyag -, és víztartalmát.

Összefoglalás termikus vizsgálatok: közvetetten számított komplexben kötött hatóanyag-tartalom → BCD komplex kedvezőbb kioldódási vizsgálat: legjobb a borneol-BCD komplex tárolási vizsgálat: – a hatóanyag-tartalom min. 70%-a megmaradt → a komplexek stabilak – borneol / mentol komplex: legkisebb hatóanyag-tartalom csökkenés illóolajok és a főkomponenseik jól formulázhatók: → magasabb hatóanyag-tartalmú folyékony permetezőszert → kontrollálható hatású, kevésbé illékony szilárd formulációkat lehet így létrehozni A termikus vizsgálat alapján a felületen tapadt hatóanyag mennyiségeit tudtam meghatározni, amiből kiszámítottam a ténylegesen komplexben lévő hatóanyagot. Ennek alapján a BCD-vel való komplexképzés volt a kedvezőbb. Elvégeztem a borneol, citrál és a timol BCD komplexének kioldódási vizsgálatait. A legjobb kioldódást a borneol-BCD mutatta. A tárolási vizsgálatok során a mintákat 50°C-on szárítószekrényben 23 napig tároltam. Megfigyeltem, hogy a minták hatóanyag-tartalma min. 70%-ban megmaradt, ezért a komplexek szilárd állapotban valóban stabilak. Megállapítottam, hogy a legkisebb hatóanyag-tartalom csökkenés a borneol illetve a mentol komplexeknél következett be. Eredményeim azt mutatják, hogy a szelíd növényvédelem irodalmában ajánlott illóolajok és főkomponenseik jól formulázhatók ciklodextrines zárványkomplex képzéssel: magasabb hatóanyag-tartalmú folyékony permetezőszert és kontrollálható hatású, kevésbé illékony szilárd formulációkat lehet így létrehozni.

Publikációk Előadás: Poszter: Oláh E., Orgoványi J., Fenyvesi É., Balogh K.: Növényvédelemben alkalmazható gyógynövény illóolajok és főkomponenseiknek ciklodextrin komplexei, Annual meeting of the Group of Carbohydrate Chemistry of the Hungarian Academy of Sciences, Mátrafüred, 2008. május 29. Poszter: Oláh E., Orgoványi J., Fenyvesi É., Balogh K.: Növényvédelemben alkalmazható gyógynövény illóolajok főkomponenseinek ciklodextrin komplexei, ELTE Tudományos Nap, Budapest, 2007. november 9.

Köszönöm a figyelmet!