Elektroforézis Általában agaróz a hordozó Különleges tisztaság, kis elektrendoozmózis DNS festése a DNS-hez kötődő fluoreszcens festékkel Ethidium bromide a leggyakoribb carcinogen Újabban a Syber green nagyon népszerű Sokkal érzékenyebb Nem carcinogen

Agaróz gél Mi ez a fragmentum itt? Vándorlás DNS felvitel helye Pozitív Negatív Kis fragmen -tumok Ezen a végén fényesebbek a fragmentumok. Miért?

Southern Blot

Pulsed Field Gel elektroforézis A hagyományos gélelfo nem jó a nagy DNS fragmentumok elválasztására Még a nagyon híg géleknél is a 40 kb-nál nagyobb fragmentumok a zsebben maradnak Kromoszóma méretű DNS-ek nem izolálhatók Alternatíva a Pulzáló Terű Gélelektroforézis Az áram irányát 90 fokkal változtatjuk időnként A kisebb molekulák gyorsabban veszik fel az irányt és gyorsabban mozognak a gélben

Minta PFG

DNS szekvenálás Sanger didezoxi láncterminációs módszere

Sanger gél Nagy fragmentumok Mekkora lehetséges legkisebb fragmentum mérete? Kis fragmentumok

Maxam Gilbert szekvenálás A bázisok közötti kötés kémiai bontása specifikusan (C, G, az összes purin, az összes pirimidin) A reakciót nem hagyjuk teljesen végigmenni Az egyik véget radioaktívan jelöljük A radioaktív fragmentumok mindig a jelzett véggel kezdődnek, a fragmentumok hossza véletlenszerű A fragmentum utolsó bázisát a kémiai tulajdonsága határozza meg

Maxam-Gilbert gél C T A G

A footprint módosított Maxam-Gilbert gél Egy általános nukleázt használunk. Véletlen hosszúságú fragmentumokat készít Az eredeti DNS molekula végét jelöljük terminális transzferázzal Ha a nukleáz kezelés előtt valami kötődött a DNS-hez, az enzim a lefedett DNS-t nem tudja hasítani Néhány sáv hiányozni fog A hiányzó sávok jelzik, hogy hol volt beborítva DNS

Footprint Kötő hely. Ha Párhuzamosan egy szekvenáló reakciót is futtatunk, akkor pontosan meg tudjuk mondani a fehérje kötőhelyének szekvenciáját.

Mutáció a baktériumokban Darwin vs. Lamarck Olyan egyszerűek a batériumok, hogy lamarckiánusok? Nem Szélesztés lemezre (Newcombe) Antibiotikum nélkül, Antibiotikummal, Mutánsok már korábban ott voltak a tenyészetben

Replica Plating Joshua és Esther Lederberg Nyomdázás bársonnyal Friss lemez Antibiotikum jelenlétében Ha nincs antibiotikum, akkor konfluens növekedés Minden telep egy már korábbi mutációt jelez.

Fluktuációs teszt Luria és Delbrück Statisztikus variáció a mintákban Egy éjszakás tenyészettel indul Mintákat vesz és széleszti fág rezisztenciára Egy mintasor ugyanabból a tenyészetből Más mintasorok különböző csövekből Széleszti, minden lemez egy egyedi o.n. tenyészetből Eltérő telepszám, fluktuáció.

Vezérelt evolúció Directed Evolution Megkérdőjelezi Luria és Delbrück elveit Azt mondja, hogy a mutáció szelekció után következik be A jelenség számos organizmusnál megfigyelhető A tipikus kísérletnél éheztetik a sejteket egy szükséges tápanyagra és azt figyelik, hogy az új mutációk mikor és milyen gyakorisággal jelennek meg

Directed Evolution Kettős mutánst sokkal nehezebb megkapni, mint az egyszerest.

Directed Evolution mechanizmusok

Hipermutabilitás Loewe et. al. (2003) Adatok több mint 10,000 generációból Mutációk/genom/nap

Roth módosította a hipotézist A dinB gén, ami a DNS polimeráz IV-et kódolja, szorosan kapcsolt a lac-hoz Ha a lac amplifikálódik, akkor a dinB is A DinB egy hibázó (error prone) enzim, ezért a mutációs ráta is nő.