Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése k cat [s -1 ] enzimvíz carbonic anhydrase 6x acetylcholine esterase 2x10 4 8x staphylococcal nuclease x10 -14

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése entrópia sztérikus hatások dinamikus hatások deszolvatáció alacsony energiájú hidrogénkötések kvantum effektusok (tunneling) elektrosztatikus effektusok (szolvatáció) Elméletek

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Reaktánsok destabilizálása (DRS) TS R P Reakciókoordináta Energia w p Átmeneti állapot stabilizálása (TSS) TS R P Reakciókoordináta Energia w p entropy, steric strain, orbital steering, desolvation solvation

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia faktor Oldószerben a reaktánsok egy „üregbe” (solvent cage) kerülését entrópiaveszteség kíséri. Enzimben már egymás közelében vannak. 100 szoros sebességnövekedés

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia faktor AB C AB ‡ A + B C AB ‡ bimolekuláris reakció monomolekuláris reakció gázfázisban kcal/mól entrópia csökkenés effektív koncentráció: 10 9 oldószerben: effektív koncentráció max. 55 M (c H2O vízben)

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia tényező AB A + B CAB ‡ C M A; 1M Bv A+B ~ 55 v wat oldószer-üreg: ~ 6 v wat k cat, AB / k cat, A+B < 10

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése valódi entrópia tényező alapállapotú konfiguráció entrópiacsökkenése felt.

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése valódi entrópia tényező mivel az enzim flexibilis, nagy (NMA, QHA = cm -1 ) azok a szabadsági fokok számítanak, melyek az átmeneti állapotban csökkennek kiszámítható (két PES összehasonlítása gázfázisban) az entrópiacsökkenés miatt ~ 1 kcal/mol „orbital steering” szintén kicsi effektus

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) A katalízis hajtóereje, hogy ez enzim a kindulási anyagok geometriáját destabilizálja és az átmeneti állapothoz hasonlóvá teszi (feszültség) TS R P Reakciókoordináta Energia w p

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) TS: sofa konformáció Alapállapot enzimben: sofa konformáció csökken Lizozim ( oligoszacharidok hidrolízisét katalizálja) ROR’+ AH ROH + R’+A - R + +A - + R’OH ROH + AH +R’OH

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) model: 1. enzim + szék konformációjú szubsztrát 2. enzim + sofa szubsztrát kiszámítása: alapáll. enzim víz

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) Miért kicsi a fehérjében a feszültség? MM model fehérje szubsztrát fehérje 1 Å változás a szubsztrátban k cat (p) /k cat (w)~ 150 felső becslés k=30 kcal/mol Å 2 5 kötésre tevődik át a fehérjében (0.2 Å kötésenként)

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) az enzim a reaktánsok konfigurációs terét úgy csökkenti le, hogy ideális legyen a reakcióhoz TS R P Reakciókoordináta Energia w p

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) Haloalkán dehalogenáz (DHlA) GS S N 2 reakció TS Shurki és Warshel (2001) J. Am. Chem. Soc. 124, pp

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) Haloalkán dehalogenáz (DHlA) pontosan definiálni kell! 1. MD szimuláció kényszerfeltétellel, majd elengedve a kényszert 2. MD szimuláció elektrosztatika nélkül (csak sztérikus effektusok)

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) sztérikus eff. 2.2 kcal/mol, de ebből 1.5 kcal/mol elektrosztatikus hatás

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Dinamikus effektusok speciális fluktuációk lecsökkentik a TS régióban töltött időt k kiszámítható, hogy a trajektóriák mekkora része visz át a TS régión

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Dinamikus effektusok „lineáris válasz közelítésben” Q: általános koordináta, oldószer hozzájárulása a  j (t)-  i (t) energiakülönbséghez  : oldott anyag dipólusmomentuma  – között változik k cat : max. 10-szeres változás

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Kvantum effektusok (tunneling) átmeneti állapot meghatározása TS elmozdítása a nyeregpontból a r.k. mentén TS optimálása a reakciósebesség számításával Cui és Karplus (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, pp Variational transition state theory (VTST) kvantum effektusok mennyire járulnak hozzá az energiagát csökkentéséhez viszonylag kis effektus, ~ szoros gyorsítás

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Kvantum effektusok (tunneling) Csak megfelelő referenciarendszer esetén van értelme! Meg kell vizsgálni az oldatfázisú reakciót is, és a kísérleti k cat értékekhez kell viszonyítani

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Deszolvatáció Nem poláros aktív helyek azzal segítik a katalízist, hogy deszolvatálják a reaktánsokat, ezzel hasonlóvá teszik a gázfázishoz. TS G.S. P Reakciókoordináta Energia w p

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció (k cat /K M )/k non ~ „a leghatékonyabb enzim” k cat /k w ~ 10 17

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció Ab initio számítások gázfázisban (MP2/6-31+G*) protonáltsági állapotok tesztelése (gázfázisú protonaffinitások) környezet figyelembe vétele makroszkópikusan reprodukálják a sebességnövekedést gázfázis vs. oldatfázis ODCase fő katalitikus eleme: az alacsony dielektromos állandójú környezet, mely hasonlóvá teszi a reakciót a gázfázisúhoz

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Florian és Warshel (1998) PNAS USA 95, pp Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Warshel és mtsai (2000) Biochemistry USA 39, pp Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció Asp-70 és Asp-75 pre-organizált környezet célja: TS stabilizáció és NEM G.S. destabilizáció

Észter hidrolízis  g desolv G.S. T.S. T.I. apoláros aktív hely poláros aktív hely

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Acetilkolin-észteráz Hipotézis: aromás oldalláncok szerepe a gázfázis-szerű környezet kialakítása átmeneti állapot stabilizációjának számítása apoláros enzimben (PDLD/LRA számítás, geometria EVB-FEP/US alapján) destabilizálásantikatalízis

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB) katalitikus hidrogénkötéseknek egy energiaminimuma van (ionos HB) Hipotézis: alacsony aktiválási energiával létrejövő, kovalens jellegű hidrogénkötések segítik a katalízist EE d d O-H....O O...H....O H 1 és H 2 dominál H 12 dominál

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB) Kiszámítható: FEP módszerrel „Kötési energia” számítással (re-organizáció, LRA) Az eredményeknek összhangban kell lenniük pKa számítások eredményeivel. LBHB apoláros környezetben jelentős effektus, polárosban nem.

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Acetilkolin-észteráz TS stabilizáció

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése : reorganizációs energia Acetilkolin-észteráz

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése aktiválási energia csökkenése reorganizációs effektussal Acetilkolin-észteráz aktiválási energia csökkenése reorganizációs effektussal 10 kcal/mol a 15 kcal/mol-ból (10 7 faktor a szeres sebességnövekedésből (k cat (p) /k cat (w)) legjelentősebb effektus

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Re-organizáció: a fehérje dipólusai úgy állnak, hogy stabilizálják a reakció átmeneti állapotát Acetilkolin-észteráz Hogyan valósul meg? Gly-118, Gly-119, Ala-201 főlánc hidrogénkötések az acetilkolin karbonil oxigénjéhez (hipotetikus kötődési modell, csoporthozzájárulások számítása)

Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése A fehérjék úgy evolválódtak, hogy a feltekeredett fehérje aminosavainak dipólusai tökéletes szolvatációt biztosítsanak a katalizált reakció átmeneti állapotának. Mivel pre-orientált dipólusok elrendeződése megfelel a reakció átmeneti állapotának, az enzimkörnyezet kis átalakuláson megy keresztül míg a reakció a reaktánsoktól a végállapotba jut. Ezért az enzimatikus effektus elektrosztatikus hatásokon keresztül fejeződik ki, mely az „oldott anyag” és a fehérje állandó dipólusai között jön létre. A dipólusok megfelelő elrendeződéséhez szükséges energia a feltekeredés során fektetődik be. Az enzimek tehát az általuk katalizált reakció „szuper-oldószerei”, mely a TS állapotnak komplementer környezetet biztosít. Annak ellenére, hogy néhány oldallánc kiemelkedő hozzájárulást ad a reakció energiagátjának csökkentéséhez, az aktiválási energia csökkentése nem bontható egyszerűen komponensekre.