alapok és alkalmazások FLUORESZCENCIA – alapok és alkalmazások

Fluoreszcencia Foszforeszcencia UV-Vis A lumineszcencia fajtái Biolumineszcencia Szentjánosbogár, gyűrűsférgek, gombák luciferin Oxidált luciferin + O2 + H2O luciferáz + fény Kemilumineszcencia * - - lúg katalizátor - - + fény H2O2 + luminol Fluoreszcencia Foszforeszcencia Fotolumineszcencia UV-Vis

Energia Jablonski diagram S2 S1 T1 S0 Abszorpció Fluoreszcencia Singlet gerjesztett állapot Triplet gerjesztett állapot Belső konverzió Rezgési relaxáció S2 “Intersystem crossing” S1 T1 Energia Abszorpció 10-15 s Fluoreszcencia 10-8 s Foszforeszcencia 10-3 – 102 s S0 Alapállapot

Abszorpciós és emissziós sávok 400 nm 700 nm

A kinin gerjesztési és emissziós spektruma Stokes eltolódás

Tetracene gerjesztési és fluoreszcencia spektruma

Fenantrén gerjesztési/fluoreszcencia/foszforeszcencia spektruma

Egy tipikus spektrofluorométer Fényforrás Monokromátor Minta Detektor Optikai rendszer (gerjesztés) Optikai rendszer (kibocsájtás)

Három-dimenziós (3D) spektrofluorométer

Quantum hatásfok vagy fluoreszcencia teljesítmény,   = kibocsátott fotonok száma abszorbeált fotonok száma = fluoreszcencia intenzitás abszorpció intenzitás As Is nx2 Dx Ax Ix ns2 Ds x = s s – standard x – ismeretlen A – elnyelés (abszorbancia) ex hullámhosszon I – a forrás relatív foton kibocsátása ex hullámhosszon n – az oldószer refraktív indexe D – a korrigált emissziós görbe alatti terület

 összehasonlító meghatározására alkalmas standardok Tartomány Vegyület Oldószer Quantum hatásfok (nm) 270-300 Benzol Ciklohexán 0.05 ±0.02 300-380 Triptofán Víz (pH 7.2) 0.14±0.02 300-400 Naftalin Ciklohexán 0.23±0.02 315-480 2-aminopiridin 0.1 M H2SO4 0.60±0.05 360-480 Antracén Etanol 0.27±0.03 400-500 9,10-Difenil Ciklohexán 0.90±0.02 antracén 400-600 Quinine sulfate 1 M H2SO4 0.546 600-650 Rhodamine 101 Etanol 1.0±0.02 600-650 Cresyl Violet Metanol 0.54±0.03 D.F. Eaton, Pure & Appl. Chem. 60 (1988) 1107-1114

A fluoreszcenciát befolyásoló hatások Molekuláris szerkezet  A legnagyobb fluoreszcencia intenzitást alacsony energiájú →* átmenetekkel rendelkező aromás funkcionális csoportokat tartalmazó vegyületeknél tapasztaljuk * * n   →* →* n→* n→* életidő (107  109)s (105  107)s molekula-pálya diagram Jablonski diagram

Bifenil Fluoreszcein Rodamin B Benzofenon Quinolin Piridine Jód-benzol folyadék: nem fluoreszcens szilárd: erősen fluoreszcens

gerjesztés kibocsájtás 2. Oldószer-hatások Példa: flavin különböző polaritású oldószerekben gerjesztés kibocsájtás Hullámhossz / nm

A fluorofór és az oldószer kölcsönhatása alapállapotú molekula környezetben h 1015 s h  108 s az oldószer molekulák alkalmazkodnak a gerjesztett molekula befogadásához oldószer molekulák minimális energiaállapothoz alkalmazkodnak alapállapotú molekula gerjesztett környezetben gerjesztett molekula alapállapotú környezetben gerjesztett molekula gerjesztett környezetben 1010 s A fluorofór és az oldószer kölcsönhatása

oldott oxigén jelenléte csökkentheti a fluoreszcens intenzitást 3. Hőmérséklet hatás  A fluoreszcencia quantum hatásfoka a legtöbb molekula esetében csökken növekvő hőmérséklet esetén  Az ütközések gyakorisága magas hőmérsékleten a belső konverzióval történő deaktiváció valószínűségét növeli 4. Oldott oxigén - hatás oldott oxigén jelenléte csökkentheti a fluoreszcens intenzitást ez a hatás a fotokémiailag indukált oxidáció következménye is lehet, vagy leggyakrabban a molekuláris oxigén paramágneses tulajdonsá-gának következtében létrejövő “quenching” (kioltás) jelentkezhet, előidézve a gerjesztett molekula konverzióját a triplet állapotba (“intersystem crossing”)

5. Koncentráció-hatás Quantum hatásfok: If =  Ia  I0() It() If =  (I0  It) I0() It() If() Lambert-Beer törvény: A =  c l  log(It / I0) =  c l  It / I0 = 10cl  It / I0 = ekcl

ln(1/T) = ln10 log(1/T)  kcl = ln10 cl If =  I0 (1  ekcl) a jel arányos I0 -lal and -vel de a koncentrációval NEM exponenciális függvény kifejtése ex = 1 + x/1! + x2/2! + x3 / 3! + ..... etc ex = 1  x/1! + x2/2!  x3 / 3! + ..... etc  ha x elég kicsi, az x2, x3 és a magasabb hatványok elhagyhatók ex = 1  x (1  ekcl)  (1  1 + kcl) If =  I0 kcl ln(1/T) = ln10 log(1/T)  kcl = ln10 cl If = ln10  I0  c l

A kinin-szulfát kalibrációs görbéje ● számított (lineáris + quadratikus + köbös) ■ kisérleti lineáris kapcsolat

A fluoreszcens intenzitást csökkentő tényezők 1. “Belső szűrő” hatás A minta mindegyik rétege elnyelel valamit a beeső sugárzásból (fényből), ami a legfontosabb oka a görbétől való elhajlásnak magas koncentrációnál. az „emissziós” monokromátor “nem látja” az innen kilépő kibocsátott fényt; magas koncentrációnál a fluoreszcens fény forrása a cellának éppen ez a régiója

2. “Ön-abszorpció” A kibocsátott fény egy részét az anyag el is nyeli Ha a Stokes’ eltolódás kicsi, az abszorpciós sáv és a kibocsájtási sáv lényeges mértékben átfed Ha az “emissziós” monokromátor széles sávszélességre van állítva, az effektus még erősebb Kombinálódhat a em-nél jelentkező “belső-szűrő” hatással 3. “Koncentráció-” vagy “ön-kioltás” (quenching) Egy másik molekulának történő sugárzásnélküli energiaátadás következtében a gerjesztett molekulák elveszíthetik energiájukat → quenching

4. Interferáló anyagok Ha egy olyan komponens van jelen, amelyiknek az abszorpciós sávja átfed a vizsgált komponens gerjesztési vagy emissziós sávjával a “belső szűrő” hatás felléphet A hatás lényeges, ha az abszorpciós erős, illetve, amikor az interferáló komponensek koncentrációja a különböző mintákban változó Az interferáló anyagok “belső szűrő” hatása még kifejezettebb, ha a minta “belső szűrő effektusa is nagy

Energia-leadás egy másik molekulának kisugárzás nélkül Quenching Energia-leadás egy másik molekulának kisugárzás nélkül 1. Collision (ütközés) → direkt energia-átadás A – fluoreszcens molekula Q – “quenching” molekula A + Q* A* + Q 2. Komplex-képződés A* + Q AQ* AQ Mindkét folyamat koncentráció-függő (Q) Q  nehéz-atomokat (pl. Br, I) tartalmazó vegyületek  páratlan elektronokat, nem-kötő elektronpárokat tartalmazó vegyületek (pl. O2)

Fluorimetriás analitikai módszerek Direkt módszerek  a minta természetes fluoreszcenciáját mérjük Származékképzés  nem-fluoreszcens anyag fluoreszcens származékát vizsgáljuk Quenching (kioltás)  az analitikai jel a fluoreszcens intenzitás csökkenése (!) kioltás (quenching) által További változatok a minta kémiai tulajdonságaitól függően lehetségesek

Szervetlen anyagok Direkt módszerek Oldott állapotban természetes fluoreszcenciával rendelkező szervetlen anyagok: a lantanidák ionjai (Sm, Eu, Gd, Tb, Dy) és az aktinidák tallium nagy feleslegű klorid jelenlétében  ón kénsavban Szilárd állapotban fluoreszkáló szervetlen vegyületek (nagy számban): Folypát (fluorspar vagy fluorit): CaF2, a fluoreszcencia szó névadója Kvarc, SiO2  a szennyeződés felelős a fluoreszcenciáért

Mg2+, Al3+, Zn2+ Be2+ Származékképzés fémionok és fluoreszcens szerves molekulák komplexei ideális, ha egyik komponens sem fluoreszcens önállóan Tipikus komplexképzők morin Be2+ 8-hydroxyquinoline Mg2+, Al3+, Zn2+

Ifo  1 = K c If Kioltási (quenching) módszerek Hátrányok: a quenching nem-specifikus  egyetlen kioltó komponens legyen csak! a mért paraméter (fluoreszcencia) a koncentrációval csökken a kalibráció általában nem-lineáris Stern-Volmer egyenlet (elméletileg lineáris kalibráció) Ifo If  1 = K c Ifo  fluoreszcencia a kioltó anyag (quencher) nélkül If  fluoreszcencia c koncentrációjú quencher jelenlétében K  Stern-Volmer kioltási (quenching) konstans Alkalmazás: oxigén-meghatározás

Szerves vegyületek Direkt módszerek Policiklikus aromás szénhidrogének: benzpyrene quinine (karcinogén) (malária-ellenes hatás)  a cigaretta-füst kátrányban erdőégetés után folyókban (traces) gyógyszeripar üdítőital-ipar Élő szervezetben: szteroidok, hormonok  általában fluoreszcensek tömény kénsavban

+ + Származékképzés A származék kiterjesztett -rendszert tartalmaz:  H2O + A származék megnövekedett rigiditású gyűrűs vegyület: +

Fluoreszcenciás detektálás Folyadék-kromatográfiában fluoreszcens detektálásra használt reagensek Minta Reagens Szerves savak Aminok és tiolok Aminok és fenolok Karbonil vegyületek 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin 7-chloro-4-nitrobenzyl-2-oxa-1,3-diazole dansyl chloride dansyl hydrazine Dansyl = 1-dimethylaminonaphtalene-5-sulphonyl

+ Ab Ag AbAg komplex FLUOROIMMUNOASSAY Fehérjék (aminocsoportok) fluoreszcens jelölésére használt fluorofórok: Fluorescein isothiocyanate Rhodamine-B isothiocyanate ex = 492 nm; em = 518 nm;  = 0.68 ex = 550 nm; em = 585 nm;  = 0.30 (Trp: ex = 280 nm; em = 348 nm;  = 0.14 Tyr: ex = 274 nm; em = 303 nm;  = 0.21)