FARMAKOBOTANIKA I. FÉLÉV / 1. GYAKORLAT

MIKROSZKÓPOS TECHNIKÁK, PREPARÁTUM KÉSZÍTÉS

Rögzítés nélküli minták vizsgálata Kézi metszetek frissen begyűjtött anyagból hisztokémiai vizsgálatok (keményítő, sejtfalanyagok, lipidek, alkaloidok szöveti lokalizációja) gyors, egyszerű többnyire keresztmetszet, viszonylag vastag A bőrszövet vizsgálata: epidermisz nyúzat tisztítás (hypo) festés

Levélderítés  színanyagok és néhány szövet kioldása  felszíni struktúrák (trichómák), sejtfalak, szállítószövet rendszer, kristályok megmaradnak vizsgálhatók Forralás: desztillált víz 10% alkohol : tömény KOH (7:3) 5% H 2 O 2 átöblítés desztillált vízzel 96% alkohol (festés)

A növényi rész feldarabolása

forralás desztillált vízben

10 % alkohol és cc. KOH oldata

forralás alkohol : KOH oldatában

kezelés 5 % H 2 O 2 -dal

átöblítés desztillált vízzel

kezelés 96 % etanollal

kész derített levéldarab

derített levél fénymikroszkópos képe

RÖGZÍTÉS (FIXÁLÁS) az életfolyamatok megszűnnek többé-kevésbé az élő állapotnak megfelelő rögzítés (tökéletes nincs) Rögzítő anyagok: sok és stabil keresztkötés kialakítása polipeptid láncok között jól penetrálnak : behatolnak a növényi szövetekbe

Rögzítő anyagok etil-alkohol:  kézi metszetek fénymikroszkópos vizsgálatra  konzervál is  keményít  jól metszhetővé tesz  víztelenít, zsugorít ozmium-tetroxid (OsO 4 ):  egyik legjobb rögzítőszer – főleg TEM  mérgező!  sejtmag és citoplazma szerkezetét jól megtartja  lassan hatol be a szövetekbe – kis szövetdarabok rögzítése

Rögzítő anyagok rögzítő keverékek: alkoholos formalin TEM – kettős fixálás: Prefixálás:- fehérjék gyors stabilizálása - monoaldehid (pl. paraformaldehid) vagy dialdehid (pl. glutáraldehid) segítségével; pufferrel oldat készítése, pH beállítása Mosás – pufferrel Posztfixálás:ozmium-tetroxiddal KONZERVÁLÁS - pl. Strassburger-Flemming féle tartósító: 100% alkohol : glicerin : deszt. víz 1:1:1 arányú elegye - így hosszú ideig eltarthatók a minták

növényi minták fixálóban

VÍZTELENÍTÉS átitató (beágyazó) anyagok: hidrofóbak elektronmikroszkóp – vákuum – csak vízmentes minták ! (ne legyen fényvisszaverés pl.) vízelvonószer sorozat: etil-alkohol: 30, 50, 70, 90, 96 és 100% (felszálló sorozat) aceton 70, 90, 100% xylol I., II. TARTÓS PREPARÁTUMOK KÉSZÍTÉSE

fixált minta

aceton 70 % aceton 90 % aceton 100 % xilol I. xilol II.

minták víztelenítése gézben

xilol I – II.

VÍZTELENÍTÉS SEM: kritikus ponton szárítás 1. nyomás- és hőmérséklet kombináció  2. mintában folyadék és felette gőz fázis sűrűsége nem különböztethető meg  3. a folyadék gőzként vonható el BEÁGYAZÁS - klasszikus: paraffin vagy paraplaszt (hidrofób) - előtte: intermedier anyag: benzol vagy xilol - beágyazás műgyantába: poliészter- és epoxigyanták (pl. Araldit, Durcupan, Technovit)

szilárd paraplaszt a termosztátban

felolvadt paraplaszt a mintákkal

paraplaszt mintatartókba

minta behelyezése a felolvadt paraplasztba

megszilárdult paraplaszt (=blokk) kiemelése a mintatartóból

blokk faragása (= trimmelés)

kész blokk

műgyantás mintatartó 10 db mintának

kész műgyantás blokk mintával

MIKROTOMOS METSZÉS Fénymikroszkópos vizsgálat: paraffin beágyazás szánka- / rotációs mikrotom: acél kés 1-2  20  m vastag műgyantás beágyazás  félvékony metszetek Transzmissziós elektronmikroszkópia: műgyantás beágyazás ultramikrotom: üveg vagy gyémánt kés, a minta mozog (az üveg olcsó, de rövidebb életidejű) nm vastag

szánkamikrotóm

mintatartó „satu”

rotációs mikrotóm

minta blokkban

A METSZETEK RÖGZÍTÉSE pl. zselatinnal vonjuk be a tárgylemezt (vagy glicerin – tojásfehérje keveréke) félvékony metszetek – melegítés – tárgylemezre tapadnak ˚C-on TEM metszetek: gridre (fémrács) FESTÉS Fénymikroszkópos festékek:  savanyú anilinfesték-oldatok: anilinkék, eozin, szudán III. és IV.  bázikus anilinfesték-oldatok: malachitzöld, szafranin, toluidinkék (= leggyakoribb)

FESTÉS Hisztokémiai festékek: - frissen gyűjtött, élő anyagból készített metszeteken sósavas floroglucin:lignin kimutatása ruténiumvörös:pektintartalmú sejtfalak szudán III.:lipidek, (illó)olajok, viasz, kutin, szuberin vas(III) - klorid:csersavak, flavonoidok Dragendorff - reagens:alkaloidok (vörös) kálium - jodidos jód:amiloplasztok (kék), aleuron (barna) (Lugol-oldat) METSZETEK ÁLLANDÓSÍTÁSA glicerin-zselatin kanadabalzsam ( kanadai balzsamfenyő)

kész preparátumok festőkádak

Kész festett preparátum (levél keresztmetszet)

Kész preparátumok kiértékelése (p. morfológiai mérések) számítógépes programokkal