A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában.

Az előadások a következő témára: "A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában."— Előadás másolata:

1 A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában

2 NTPDázok: ektonukleotidázok, melyek az extracelluláris nukleotidok gamma és béta foszfátját különböző sebességgel hidrolizálják aktivitásuk befolyásolja a P2 receptorok általi jelátvitelt jelentős szerepük a vaszkulatúrában Az NTPDázok nemcsak terminálják (P2Y2) vagy aktiválják a P2 (P2Y1, P2Y3, P2Y12 és P2Y6) a különböző P2 receptorokat és aktiválják az adenozin receptorokat is

3 NTPDase1 (CD39, 78 kd) megakadályozza az ADP- kiváltotta vérlemezke összecsapzódást Jellemző: endothel, endocardium és simaizom/szívizom sejtekben posztranszlációs módosulás után a kaveolákban dúsul fel Fő ektonukleotidáz a vaszkuláris és trofoblaszt szövetekben.

4 glikoszfingolipidek + hosszú, egyenes zsírsavláncú lipidek normál lipidek kaveolin GPI kapcsolt enzimek és receptorok palmitilált SCR kinázok kaveolához kötődő, jelátvitelben szereplő transzmembrán receptorok Kaveola

5 Van-e kolokalizáció a P2Y1 és/vagy P2Y2 receptorokkal egy olyan szövetben, ahol az NTPDáz1 bizonyítottan az elsődleges ektonukleotidáz?

6 P2Y1P2Y2 Humán placenta

7 CD39- cytotrophoblast CD39- syncytiotrophoblast

8 CD39- P2Y1 Szövet: humán placenta, endothelsejt

9 P2Y1- EC

10 Tokuyasu eljárás (1980) – ultrakriosztátos metszeteken végzett immunreakció Előnyei: gyors (fixálástól EM vizsgálatig 1 nap elég lehet) a szöveteket elég PA-del fixálni intracelluláris antigének könnyebb kimutatása többszörös immunarany jelölés lehetősége Hátrány:ultrakriosztát kell (feltét az ultramikrotómhoz) folyékony nitrogén kell (sok) kés (lehet üveg vagy gyémánt, de metszeni tudni kell) szöveti kép „más” (az új módszer jelentősen javítja a minőséget) kis blokkméret

11 Általános eljárás: Perfúziós vagy immerziós fixálás majd a fixáló kimosása ~ 2 mm 3 térfogatú szöveti blokk kivágása Cseppben (3X) végzett krioprotekció (2.1 M szaccharóz /PBS / 0.2 M glicin) 15-30 perc Metszés : -120 ° C-on (gyémántkés) vagy -90 ° C (üvegkés) metszetek felvétele: 1:1 2.3 M szaccharóz -2 % metilcellulóz cseppel ráhelyezni szenezett, formvarhártyás rácsra Az immunreakció cseppeken történik, a metszeteket sosem szabad kiszáradni hagyni. Az eljárás megeygezik a szokványos immunnal (blokkolás, inkubálások, mosások - idő mindössze kb 2 óra) utófixálás: 1% GA Kontrasztozás: 9 rész 2% metilcellulóz : 1 rész 3 % uranilacetát 5 °C

12 Toshihiro Takizawa, Clark L. Anderson, and John M. Robinson A New Method to Enhance Contrast of Ultrathin Cryosections for Immunoelectron Microscopy The Journal of Histochemistry & Cytochemistry Volume 51(1): 31–39, 2003 http://www.jhc.org Humán placenta

13 A módosítás előnye: nagyobb kontraszt, szebb szöveti kép (itt pozítív festés, a klassszikus eljárásnál negatív festés van) Eljárás 2 óra 4 % PA - kakodilát puffer, mosás, beágyazás 10% zselatinba (kakodilát pufferben) ezt vágják pici blokkokra és itatják át szaccharózzal (kakodilát puffer). Metszés. A metszeteket 0.75% zselatin–2.0 M szaccharóz vagy (1% metilcellulóz –1.15 M szaccharóz cseppekkel viszik és 0.25% polilizines üveg fedőlemezekre vagy formvarhártyás, szenezett EM rácsokra. Amennyiben az oldatban 0.05% Na-azid is van, 4°C-on tárolható az immunfestésig

14 Utófixálás: 1–2% ozmium tetroxide 0.1 M kakodilát pufferben, pH 7.4, 15 perc, RT, mosás Beágyazás : a polivinil alkohol (PVA)-technika módosított változata : 0.8% UA–1.6% PVA, 15 perc, gyors PVA mosás Kontrasztfestés: 0.0015% ólomcitrát - 2% PVA 15 perc RT A felesleg leitatása, szárítás... Másik lehetőség : utófixálás 2% ozmium tetroxide – 1.6% K-ferrocianid / 0.1 M kakodilát puffer, pH 7.4, 15 prec

15 utófixálás : 2% ozmium tetroxid – 1.6% K-ferrocianiddal Humán placenta ( JHC, 51(1): 31–39, 2003)