Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) P olarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE) - csere-spektroszkópia.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) P olarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE) - csere-spektroszkópia."— Előadás másolata:

1 NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) P olarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE) - csere-spektroszkópia (DNMR) (55 ábra) Szalontai Gábor 2014 november 5.

2 Cél = térszerkezet vizsgálat Alapja: mágnesezettség-átvitel = polarizáció-átvitel Magtávolságok becslése, mérése Érzékenységnövelés ( 13 C, 29 Si, … 103 Rh, stb. magok mérése) Segítség a hozzárendelésben

3 Mágnesezettség (polarizáció) átvitel: eredendő jelerősség ( 1 H vs. 13 C magpár)  négyszer annyi proton mag van az alsó szinten mint a 13 C !  a proton négyszer olyan erős dipól mint a 13 C !  a protonok négyszer olyan gyorsan precesszálnak mint a 13 C -k! tehát 4*4*4 = 64 =  3 -szor erősebb lesz a proton jele! Ráadásul: mivel a 13 C természetes előfordulás csak 1,1 %. 

4 Elvi maximumok (besugárzott mag : 1 H) Mért mag (X) Giromágneses állandó,   rad    s    Max. NOE hatás I=I o (1+  H /2  X ) Max. polarizáció átvitel I=I o |  H /  X | 13 C 6, Rh ,89 31,78 15 N -2,711 -3,94 9,87

5 Emlékeztető (1): a relaxáció és mérése Beolvasás 90 o (x) Inverzió 180 o (x) Az inverzió (átfordítás) óta eltelt t idő

6 Emlékeztető (2): a relaxáció s mechanizmusok Csak a dipoláris mechanizmus felelős a NOE effektusért!

7 Emlékeztető (3). Feltétel olyan molekuláris mozgások megléte, amelyek frekvenciája a Larmor frekvenciák tartományába esik.

8 Példa nagy molekulára: ciklodextrin (-D-glucopyranose)- n  -CD : 174 Å 3  -CD : 262 Å 3  -CD : 427 Å OH (3) CH 2 -OH (6) OH (2)

9 Példa eltérő méretű molekulák (  -CD és etanol (ms= 46 ) keverék) relaxációja t megfelelő megválasztásával elérhető, hogy csak a gyorsabban relaxáló molekula (esetünkben az  -Ciklodextrin ms=974) jelei látszanak!

10 A mag (Nuclear) Overhauser (NOE) jelenség: szelektív vagy szélessávú besugárzás hatására bizonyos magok jeleinek intenzitása megváltozik !!! ( valójában a mag relaxáció egy válfaja, eredetileg elektron-mag párokon tapasztalta Overhauser )

11 NOE jelenség: végy egy dipolárisan csatolt I,S magpárt (D IS > 0 Hz) (4N mag) és alkalmazz szelektív telítést (S)!      1I S  1S mm átme- netek egyen súlyban S telítése után   S             1I S  1S

12 A NOE lényege : S mag besugárzása következtében fellépő I mag betöltöttség-szint változás ( inkoherens polarizáció-átvitel) A NOE mértéke: W 0, W 1 és W 2 a zéró -, az egy- és a két -kvantumos relaxációs folyamatok valószínűségét jelentik

13 NOE = f(relaxációs szintek = 1/  s  I  Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség- különbségével arányos, egy-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága  C a molekuláris korrelációs idő  I és  S az I és S magok Larmor frekvenciái

14 NOE = f(relaxációs szintek = 1/  s  I  Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség- különbségével arányos, zéró-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága  C a molekuláris korrelációs idő  I és  S az I és S magok Larmor frekvenciái

15 NOE = f(relaxációs szintek = 1/  s  I  Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség- különbségével arányos, két-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága  C a molekuláris korrelációs idő  I és  S az I és S magok Larmor frekvenciái

16 Emlékeztető: egy - és több-kvantum koherenciák: egyszerűsített fizikai kép (AX rendszer) A X A + X MQ:  M= +/- 2, 3,... mindig antifázisúak és emiatt nem észlelhetőek... SQ:  M= +/- 1, ezek észlelhetőek...

17 Több-kvantum koherenciák tulajdonságai A rendűséggel ( p ) arányosan változnak az átmenetek frekvenciái ( p *f 1 ). Ahol f 1 = a gerjesztő rf tér frekvenciája. Ennek megfelelően változnak a fáziscsúszások is a gerjesztő impulzus szögéhez képest ( p *  1 )… A zéró-kvantumos átmenetek függetlenek ettől a hatástól. Gerjesztési eljárás: 90 o -t-180 o -t-90 o ( p =2, 4, 6,...stb)

18 A homonukleáris NOE maximális értéke (ha  2  2 2 << 1) W 0, W 1 és W 2 a zéró, egy és két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik Független a két mag távolságától!!?

19 A heteronukleáris NOE maximális értéke (ha  2  2 2 << 1) W 0, W 1 és W 2 a zéró, az egy és a két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik

20 A NOE függése a molekuláris mozgásoktól: a molekulaméret, az oldószer (viszkozitás), és a hőmérséklet hatása 0,5 -1,0 NOE maximum  C << 1 kis és közepes molekulák W 2 > W 0 mw = között W 2 ~ W 0  C >> 1 mw > 2000 W 2 < W 0 NOESY ROESY

21 A mért NOE-kból számolható (becsülhető) magtávolságok Két-spin esetek: aholp* = egyéb egy-kvantumos dipoláris relaxációs hozzájárulás  C = molekuláris korrelációs idő Relatív magtávolságok két eltérő molekulán mért NOE értékek alapján csak akkor összevethetőek, ha....  C azonos a két mintában teljesül a     C << 1 feltétel p* közel azonos a két molekulában Több-spin esetek egy molekulán belül:  A (B) =  C (B) = 0,5 is lehet! A növekedés léte még nem elegendő bizonyíték a két mag „közelségére”... A növekedés hiánya még nem elegendő bizonyíték a két mag „távoliságára”...

22 Egyensúlyi NOE hatások mérése : kvázi folyamatos besugárzással egy új egyensúly jön létre! A NOE felépülést mérő eljárások: a besugárzás időtartama rövid a relaxáció idejéhez képest!

23 1 H 180 o pulzus 90 o "kemény" akvizició a kiválasztott átmenet szelektív átfordítása egy 180 o -os pulzussal NOE felépülési szintet mér, ami ~ r 6 IS "Tranziens" NOE-k mérése egy dimenzióban: a besugárzás szelektív és sokkal rövidebb mint a relaxációs időállandó!    "Tranziens" NOE-k mérése két dimenzióban (NOESY kísérlet) f(   ~ r 6 IS pulzus 90 o akvizició t 1 90 o o keveredési idõ ~ T 1

24 Emlékeztető: a kettős-rezonancia kísérletek (B 1, B 2 ) (I) Szelektív spin-lecsatolás: B 2 = lecsatoló tér

25 Kettős-rezonancia kísérletek (II): szélessávú protonlecsatolás X { 1 H}: fenn: normál X spektrum{1H} középen: protoncsatolt X spektrum lenn: NOE nélküli X spektrum(mennyiségi kiértékelés)

26 Homonukleáris NOE kísérlet: Heteronukleáris NOE kísérlet: 13 C{ 1 H} 31 P{ 1 H} 15 N{ 1 H} 29 Si{ 1 H}  max = 0,5*  H /  X 1,98 1,14-2,94 -0,52 Ez is szelektív besugárzás: B 2 = szelektív tér

27 2D eljárások: tranziens NOE mérése a molekula összes magja között: NOESY = DQF-COSY 90 o (x) t 2 állandó 90 o (x) t 1 változó B 1 (90 o )x COSY M x =Msin2  t 1 M z =Mcos2  t 1 B 1 (90 o )x t m keveredési idő NOESY

28 2D NOESY Csak a zéró-kvantumos z- mágnesezettséget kell megőriznünk, az egy - és két -kvantumos koherenciák kidobandók pl. egy nyolclépéses fázisciklus alkalmazásával!

29 NOESY: nem kívánt mellékhatások, egyéb komplikációk A NOE csak a z -mágnesezettséget befolyásolja ( zéró rendű, ZQC ), tehát érzéketlen az rf impulzusok fázisára (tehát a fázisléptetésre immunis!) Zéró rendű koherenciák azonban létrejönnek a (NOESY= DQF-COSY) szekvenciában a J-csatolt magpárok között is! Ezektől kell megszabadulni, hiszen ezek COSY keresztcsúcsokat produkálnak! a COSY eredetű zeró kvantumos (ZQC) koherenciák intenzitás változásai  m keveredési idő,  m  m kis mértékű, véletlenszerű változtatása törli a COSY eredetű keresztcsúcsokat! NOE

30 A keveredési idő,  m he lyes megválasztása: mennyi időt hagyjunk az átvitelre? NOESY keresztcsúcs intenzitások nagy molekulák, viszkózus oldatok: lassú molekuláris mozgás kis molekulák: gyors molekuláris mozgás keveredési idő,  m A kísérlet kulcsa  m helyes megválasztása: kis molekulák (< 500 D) esetében a becsült T 1 körüli (0.5 – 2.0 s) érték általában megfelelő. Nagyobb molekulák esetében ( D között) a jel elveszhet. Igazán nagy molekulák (a negatív NOE-k tartománya) esetén 0.5*T1 az ajánlott érték!

31 Tranziens NOE: kinetika, mérés a lineáris növekedés tartományában  m   1/r IS -6  S  k’ *r IS -6*  C a lineáris növekedés tartományában a magok izolált spin-párként viselkednek, ezt lehet kihasználni a távolság mérésére! NOE= kereszt-relaxációs szint

32 Vége az első résznek … Most néhány alkalmazás következik és az alapvető 1D és 2D NOESY és ROESY szekvenciák szintén alkalmazási példákkal fűszerezve.

33 Alkalmazási példák: magtávolság, r AB mérés - ha a molekuláris korrelációs idő,  c ismert, r AB közvetlenül számolható (  c meghatározható pl. a 13 C relaxációs idő mérésekből) - gyakoribb megoldás egy ismert r XY referencia távolság használata (pl. két metilén proton távolsága állandónak tekinthető ~1.4 Å) η A (B)/η X (Y) = r AB -6 / r XY -6 Figyelem: dinamikus átlagot kapunk!

34 2D eljárás: NOESY példák (ciklosporin (undekapeptid) C 6 D 6 ) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison levőkhöz képest (csak a p ozitív NOE tartományban m w < 1000 ) A k émiai csere (lásd később) viszont a diagonálissal a zonos fázisú jeleket hoz létre, ennek alapján ezek könnyen megkülönböztethetőek!

35 2D eljárás: NOESY (pravastatin, noesy-gp-ph) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa azonos a diagonálison levőkével (csak a n egatív NOE tartományban van így, mw = 409 !!) )

36 2D eljárások: NOESY példák (szekvencia: noesy-gp-ph) 31 P- 31 P térbeli korreláció NOESY-GP-PH szélessávú proton lecsatolással: Csak a 195 Pt - 31 P szatellit jelei mutatnak egymással keresztcsúcsokat, ezek feltehetően a 195 Pt spin-állapotváltozásai (relaxáció) miatt fellépő csere- keresztcsúcsok! A fázisuk megegyezik a diagonálison lévő jelekével! A főcsúcsok (a 193 Pt-hoz kötött 31 P magok) nem mutatnak térbeli közelséget vagy cserét!

37 1D NOESY szekvenciák: differencia spektroszkópia 180 o (x) szelektív átfordító impulzus t 2 állandó 90 o (x) t m keveredési idő 1. Általában pontos mag távolság meghatározásra használják, több keveredési idővel veszik fel a spektrumokat, amelyek egy referencia („üres” helyen gerjesztett) spektrumot is magukba foglalnak... A differencia –spektroszkópia összes hátránya jelen van! = differencia spektrum = NOE hatások

38 Szelektív differencia NOE vs. 1D gradiens NOESY 180 o (x) szelektív impulzusok 90 o (x) t m keveredési idő Double Pulse Field Gradient Spin Echo: - kiválasztja (előjelét átfordítja) a kérdéses rezonanciát és csak az ebből származó polarizációt tartja meg, a többit a gradiensek szétszórják! Csak a növekedést mutatja ott, ahova a polarizáció került differencia spektroszkópia nélkül! A viszonylag hosszú  m (>300 ms) alatt a „szétszórt” mágnesezettség is relaxál, ezért nem kívánatos z- komponensek jelennek meg, ezeket egy négylépéses fázisciklus (EXORCYCLE) kiszűri, mert nem teljes, hanem csak kis jelekről van szó. 90 o (x) 180 o (x) szelektív impulzus z-gradiensek Shaka et al. J.Magn.Res. 125, (1997) „tiszta fázisú” gerjesztési profilt eredményez!

39 Tranziens vs. egyensúlyi NOE (a tranziens eljárás sajátságai) -a növekedés igen erősen függ a használt keveredési (csere) időtől, -a növekedés függ a kiválasztott (besugárzott) jel inverziójának (átfordításának) pontosságától is, -a százalékos növekedés számítása nem egyszerű, az átfordított jel itt nem használható egyszerű referenciaként és az inverziót is skálázni kell 100 %-ra, -a növekedés százalékos abszolút értéke kisebb lesz mint az egyensúlyi NOE esetében, de általában jobban észlelhető!

40 Tranziens vs. egyensúlyi NOE: 1D példák (1) pravastatin (tranziens NOE) ( 180 o, pulzus forma = GAUSS ) szelektív besugárzás: 5.5 ppm, 88 ms, 67 dB, gerjesztett tartomány kb. 25 Hz! A fázisciklus miatt fellépő kivonási maradék ( selnogp szekvencia)

41 NOESY vs. Rotating frame nOE SpectroscopY 0,5 -1,0 NOE maximum  C << 1 kis és közepes molekulák W 2 > W 0 mw = D között W 2 ~ W 0 w  C >> 1 mw > 2000 W 2 < W 0 NOESY ROESY Az átmeneti tartományban a leghasznosabb, ahol a NOESY keresztcsúcsok nagyon kicsik, változó előjelűek vagy teljesen hiányoznak!! log(w  C )

42 ROtating frame noE SpectroscopY A hagyományos NOESY mérés ( z polarizáció változást mérünk) legnagyobb problémája, hogy  o  C ~ 1 közelében ( D) nincs jól mérhető jel! Viszont a spin-lock tér* (tranzverz polarizáció létezik) körülményei között a molekula méretétől függetlenül gyakorlatilag csak növekedés van, nagyon nagy molekulákra a maximális ROE érték az elméleti NOE kétszerese! Lásd a kereszt- polarizációra vonatkozó alábbi összefüggést!  C >> 1

43 ROESY: a hagyományos 1D eljárás 180 o (x) szelektív impulzus t 2 (állandó) 90 o (x) t m keveredési idő Az ún. spin-lock tér (B 1 ) ideje alatt (keveredési idő) változnak meg a Z- szint betöltöttségek a dipolárisan csatolt magok között!  B 1 <<  B o tehát  1  C << 1

44 ROtating frame noE SpectroscopY: mit jelent a forgó koord. rendszer és a spin-lock tér? Spin-lock tér : a Hartmann-Hahn feltétel teljesülése alatt a mágnesezettség az Y-tengely mentén helyezkedik el … tranziens NOE kísérlet: ( longitudionális ) NOE kísérlet a forgó koordináta rendszerben: ROE (tranzverzális) 180 o (x) szelektív impulzus 90 o (x) szélessávú gerjesztés

45 Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: 2D Spin-lock tér y 90 o (x)  m spin-lock keveredési idő t 1 idő Spin-lock tér y (homonukleáris spin-echo kísérlet) 180 o (y)  n A protonok azonos effektív teret éreznek, csak a homonukleáris J és D -csatolások aktívak, így polarizáció- átvitel játszódik le a dipolárisan csatolt spinek között!!

46 Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: zavaró jelek - COSY keresztcsúcsok (J-csatolás). - TOCSY átvitel a J-csatolt magok között a spin-lock tér ideje alatt. - rf off-rezonancia hatások miatt keresztcsúcs gyengülés lép fel.

47 ROESY vs. NOESY : pravastatin só mw= 409 (anion)

48 ROESY pravastatin 400 ms DMSO ns=8 t=5 h d1=4s TD=512 (F1) A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison lévő jelekével ! Kivéve a kémiai csere következtében fellépő keresztcsúcsokat !

49 A keresztcsúcsok fázisa azonos (?) a diagonálison lévő jelekével, annak ellenére, hogy viszonylag kis molekuláról van szó ( D)! Szokatlan eset!! Gyengék a jelek, különösen az F1 dimenzióban. A csere- keresztcsúcsok itt nem azonosíthatóak! NOESY pravastatin só: 400 ms DMSO ns=8 t=2,5 h d1=4s TD=256 (F1)

50 Kétdimenziós csere-spektroszkópia ( EX change S pectroscop Y, EXSY ) A kémiai környezet változása következtében változó mag környezet természetesen befolyásolja a spektrumot. Hasonlóan a NOE hatásokhoz a csere is csak a z- mágnesezettséget befolyásolja (zéró rendű), tehát érzéketlen az rf impulzusok fázisára! A detektálás feltétele: a folyamatnak lassúnak kell lennie a vizsgált mag NMR időskáláján (külön jeleket kell látnunk), de nem szabad túl lassúnak sem lennie, mert a relaxáció korlátot szab a jel detektálásának. Ez azt jelenti, hogy a detektálható cseresebességek, k ex kb. a s-1 tartományban vannak!

51 A dinamikus NMR jelenség A spin-állapotok véges időtartamának hatása az NMR jelek félérték-szélességére. (a) csere nélküli állapot, csak T 2 által meghatározott (b) csere által megszélesített jelalak (egy véges időtartamú állapot energiája nem határozható meg pontosan )

52 2D eljárások: csere mérése a molekula összes magja között: szekvencia = DQF-COSY = NOESY = EXSY 90 o (x) akvizició 90 o (x) t 1 változó B 1 (90 o )x COSY M x =Msin2  t 1 M z =Mcos2  t 1 B 1 (90 o )x t m (keveredési) csere idő EXSY = NOESY

53 2D eljárások: csere-spektroszkópia (EXSY) (példa az azonos fázisra) Csere- keresztcsúcsok: fázisuk azonos a diagonális fázisáéval! NOE- keresztcsúcsok: ezek fázisa is azonos a diagonálissal, mert a molekula mérete miatt ( ~ 5000 D) a negatív NOE tartományban vagyunk!

54 2D eljárások: csere-spektroszkópia (ROESY-EXSY) (példa az eltérő fázisra) Csere- keresztcsúcsok: fázisuk mindig azonos a diagonálissal! A ROE- keresztcsúcsok fázisa mindig ellentétes a diagonálissal.

55 Ajánlott irodalom Jackman-Cotton 1975, Academic Press Delpuech 1995, Wiley Dinamikus NMR: NOE, NOESY: D.Neuhaus and P.Williamson: The NOE in Structural and Conformational Analysis VCH Publisher, 1989 Weinheim


Letölteni ppt "NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) P olarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE) - csere-spektroszkópia."

Hasonló előadás


Google Hirdetések