Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (2.) immunoblot immunhisztokémia áramlási citometria.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (2.) immunoblot immunhisztokémia áramlási citometria."— Előadás másolata:

1 Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (2.) immunoblot immunhisztokémia áramlási citometria

2 Az immunoesszék érzékenysége

3 Antigén azonosítása Western blot módszerrel Lépések: 1.minta előkészítés ( szöveti vagy sejtes) 2.gélelektroforézis 3.blottolás 4.jelölés 5.előhívás Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására Anode(+) Cathode(-)

4 Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag- epitóp kölcsönhatás alapján Western Blot

5 Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

6 Fab Fc Epitóp a protein felszínén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag Torma- peroxidáz Immobilizált proteinek Membrán H2O2H2O2 H2OH2O luminol enhancer h Detektálás Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H 2 O 2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül szeresére növelhető (enhancer) luminol

7 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (1. )

8 Cytokine array A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít ( - ) IFN  ( + ) IL-2IL-4… … MIP3β… különféle kikötött specifikus ellenanyagok Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Jelzett ellenanyagok keveréke Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

9 CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokin termelése Réthi és mtsi. 2006

10 Immunhisztokémia Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) PE – fikoeritrin (narancssárga) Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz ( a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)

11 Szövetminta FIXÁLÁS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA

12 Immunhisztokémia ABC Technika Avidin Szövetmetszet Sejtek (sejttenyészetek) Tárgylemez Primer antitest Biotinált Enzim Szekunder antitest

13 Hagyományos hisztokémia Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

14 Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

15 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

16 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

17 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

18 Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endotél sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt.

19 Áramlási/áramlásos citometria A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az immunofluoreszcenciai módszerek eszköztárába tartozik, használatuk kiegészíti egymást Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket, partikulumokat vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas (akár több millió sejt percek alatt) (akár több millió sejt percek alatt)

20 Az áramlási citometria mint az immunrendszer vizsgálatának adekvát eszköze Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található, könnyen sejtszuszpenzióba vihető, fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és sejtenként vizsgálható. A nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. (pl. sejtpopulációk százalékos aránya) Kis százalékban jelenlevő sejttípusok vizsgálatára is alkalmas (pl. adott antigénre specifikus limfociták, ritka sejtpopulációk vizsgálata) Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle. (pl. sejtaktivációt kísérő változások, betegségek progressziójának nyomon követése)

21 asztali áramlási citométer szorter-áramlási citométer (FACS)

22 Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése PMT 1 PMT 2 PMT 4 dikroikus tükrök sávszűrők Laser áramlási cella PMT 3 minta FSC detektor fotodióda fotoelektron- sokszorozó csövek (PMT = photon multiplayer tube) Többféle fluoreszcens szín, és a megvilágító fényforrás sejteken szóródó fénye is mérhető. Fel lehet fogni fluoreszcens mikroszkópként ami alatt áramlik a minta – de nincs képalkotása, csak fényintenzitás mérés.

23 Lézer Fényszórás és fluoreszcencia Kis szögben szóródó fény detektora (FSC-forward angle light scatter szenzor) Többé kevésbé a vizsgált partikulumok, sejtek méretével arányos fluoreszcencia detektorok oldal irányú fényszórás (SSC-side scatter) detektora – a sejtek granuláltságát jellemzi A több színű festések lehetővé teszik sejtek alpopulációinak azonosítását is (autofluoreszcencia - piridinek és flavinok jelenléte miatt)

24 B NK Th Tc A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk Fluoreszcens mikroszkóppal valami ilyesmit látnánk

25 Fókuszált lézernyaláb Th nagy sebességű folyadékáram (küvettában, vagy szabadon) CD4 FITC CD8 PE detektor A CD4-FITC jelölt (T H ) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont növekvő fényintenzitás mikroszkóppal:

26 Tc detektor A CD8- PE jelölt (T c ) sejt detektálása CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás

27 B detektor A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B sejtek) CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás mikroszkóppal halványnak látszó (autofluoreszcens) sejt

28 kvadráns statisztika CD8 PE CD4 FITC 38% 0% 44% 18%

29 Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot

30 Ábrázolásmódok 2. Hisztogramm (Homogén sejtpopuláció hisztogrammja a normál eloszlásnak megfelelő) Az intenzitás értékek számszerűsíthetőek: ~ 7 ~ 1300

31 A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van előre irányuló fényszórás (FSC) („méret”) oldal irányú fényszórás (SSC) (pl.granuláltság) granulociták monociták limfociták

32 Perifériás vér vizsgálata hematológiai automatával Mért paraméterek: peroxidáz festés (mieloperoxidáz jelenléte, x – tengelyen) fényszórás (nagy granulált sejteknél magas, y –tengelyen) 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombociták 4 Limfociták és bazofilek 5 Nagy nemfestődő sejtek (LUC) 6 Monociták 7 Neutrofilek 8 Eozinofilek Csak a főbb sejtípusokat lehet meghatározni vele

33 Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének alapján Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van. Diagnosztikus értékű lehet: - a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása - rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése - egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése Példák: - gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának növekedése - HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T sejtek számának csökkenése CD4+ : CD8+ = 1.6 Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/  l HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T sejt szám <200/  l (arány „átfordul”) - CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része

34 WAS: Wiscott-Aldrich Syndrome (WAS protein defektus) XLA: X-linked Agammaglobulinemia (Btk defektus) B-sejtek fejlődésének megrekedése egyik jellemző tünet: CD19+ B sejtek hiánya egyik tüneti jellemzője sok közül: CD43 expresszió alacsony v. hiányzik Immundefficienciák diagnosztikája áramlási citometriával

35 CD antigénsejttípusfunkcióligand CD3T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28T sejtek kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152

36 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (2.) (áramlási citométerrel)

37 Cytometric bead array (CBA) A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer. A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják CBA cytokine array IL-2 IL-4 IL-8 … … IL-12IL-23IL-17……

38 Cytometric Bead Array A citokinek mennyiségére egy eltérő színnel jelölt ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk IL-2 IL-4 … … Standard citokinek a koncentráció meghatározásához citokin capture gyöngy citokin reporter ellenanyag Az eljárás kis térfogatokkal (5-20  l) is működik, de műszerigényes.

39 Szendvics ELISACBA Cytometric multiplex bead array (CBA) IL-2 IL-4 IFN 

40 IL-8 IL-1β IL-6 IL-12IL-10 TNFα Citokin mennyiség Citokin standard hígítási sorozat 500pg/ml250pg/ml125pg/ml62pg/ml31pg/ml16pg/ml8pg/ml 0

41 Szerzett immunhiányos szindróma (Acquired Immune Deficiency Syndrome – AIDS) Bizonyos betegségek az immunrendszer szupresszióját, vagy működésének zavarát okozhatják. A XX. század elején, amikor a tuberkulózis volt a legfőbb halálok, s a népesség 50%-a tuberkulin-pozitív volt, jól ismert volt az a tény, hogy egy egyidejű kanyarófertőzés az egyébként problémamentes TB-fertőzés hirtelen súlyosbodásához és halálhoz vezethet. A pontos mechanizmust mára tisztázták: az immunszupresszió hátterében az IL-2 szintézis csökkenése áll, miután a kanyaró vírus a makrofágok CD46 vagy a SLAM receptorához kötődött.

42 Az immunválaszra gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok egy része a limfocitákat fertőzi. A HIV (Human Immunodeficiency Virus) ijesztő példája annak, hogy milyen következményekkel jár, ha az immunsejteket egy mikroorganizmus megfertőzi és elpusztítja. A HIV receptora a T-sejtek felszínén lévő CD4 molekula. A CD4 molekula a makrofág típusú sejtek felszínén is expresszálódik, így a vírus ezeket a sejteket is képes megfertőzni. A klinikai lappangás ideje hosszú, általában több év. Ezalatt mind a CD4+ sejtek, mind a vírusrészecskék gyorsan pusztulnak és újratermelődnek. Amikor a CD4+ sejtek nagyobb arányban pusztulnak el, mint ahogy a szervezet képes lenne regenerálni őket, számuk olyan alacsony értéket vesz fel, hogy a sejtközvetített immunitás működésképtelenné válik. A sejtközvetített immunválasz hiányában a gazdaszervezet halálos kimenetelű opportunista fertőzések áldozatául eshet.

43 Esettanulmány: A Pinkerton-család: fertőzött vér okozta tragédia Benjamin Pinkerton az USA haditengerészetének századosa volt és Japánban teljesített szolgálatot. A szolgálati idő alatt feleségül vett egy japán nőt, aki 1987-ben két egészséges leánygyermeket szült. Négy évvel később született egy fiú is, aki szintén egészségesnek tűnt. A fiú öt hónapos korában megkapta a diftéria toxoiddal, valamint pertusszisz baktériummal és tetanusz toxoiddal (DPT), továbbá orális poliovakcinával végzett rutin immunizálást. Ezeknek az oltásoknak nem volt mellékhatásuk és a gyermek jól fejlődött. Hathónapos korában megbetegedett és fogyni kezdett. Súlyos, tartós hasmenés lépett fel, amely lázzal járt. Szájüregében szájpenész terjedt, és gyors egymásutánban kétszer esett át középfülgyulladáson. A haditengerészet kórházának orvosai többször vizsgálták a fiút és antibiotikum kezelést írtak fel, ami hatástalannak bizonyult. A fizikai vizsgálat eredményei: - testhőmérséklet 38 o C - szájpenész a nyelv oldalsó felszínén és a száj belső oldalának nyálkahártyáján (candidiasis) - pelenkakiütés, melyet szintén Candida fertőzés okozott - belégzéskor mindkét tüdőfélben finom, szörtyögő zaj hallatszott

44 Laborvizsgálatok: - normális fehérvérsejt-szám (6500/  l); - az egyes fehérvérsejtek aránya szintén normális volt (neutrofilek 62%; limfociták 30%; monociták 5%; eozinofilek 2%; bazofilek 1%); - normális immunglobulin szintek: - szérum IgG: 997 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); - szérum IgM: 73 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); - IgA: 187 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); - a limfociták vizsgálata során normális mennyiségű CD8 + T sejtet találtak, míg a CD4 + T sejtek aránya nagyon alacsony volt, mindössze 85/  l (fiziológiás: /  l); - intradermális Candida antigén nem váltott ki késői típusú hiperszenzitivitási reakciót; - a szérumban ELISA módszerrel és Western-blot technikával HIV elleni antitesteket mutattak ki

45 Orális candidiasis nyelőcsövi candidiasis

46 Gombafertőzés okozta pelenkakiütések

47 VIZSGÁLATI MÓDSZER VIZSGÁLT FEHÉRJÉK MINTADETEKCIÓ ELISA Anti-HIV IgG ill. IgM antitestek szérum (esetenként vizelet vagy nyál is) másodlagos (conjugate-) anti- humán IgG antitestekkel Western blot HIV burokfehérjék: gp41, gp120, gp160; Core: p17, p24, p6, ill. p7 szérum másodlagos (conjugate-) anti- humán IgG antitestekkel E felismerést követően a fenti módszerekkel ellenőrizték a szülőket is: mind az apa, mind az anya HIV-antitestre pozitívnak bizonyult. A HIV-diagnosztika során elsőként mindig ELISA-módszerrel vizsgálják a mintákat. Pozitív eredmény (reaktív szérum) esetén két további vizsgálat szükséges (2. és 3. vizsg.). Ismételt reaktivitás esetén az egyén mintáját verifikálják: leggyakrabban Western blot - os mérést, vagy újabb ELISA - mérést végeznek.

48 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, a felszínén HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

49

50 Míg Pinkerton százados jó egészségnek örvendett, felesége gyengélkedett és állandó hőemelkedésről és a nyaki nyirokcsomók duzzanatáról panaszkodott. Kiderült, hogy a fiúgyermek születése előtt két évvel a nő terhes volt. A terhesség vége felé a magzat meghalt, s császármetszéssel kellett eltávolítani. A nő jól viselte a műtétet, de a vérveszteség miatt vérátömlesztésre volt szükség, mely során 2 egység vért kapott. A gyermek egymás után két súlyos Pneumocystis carinii illetve Pseudomonas aeruginosa fertőzésen esett át. Súlyos köhögés alakult ki nála, amely során véres köpet termelődött (hemoptysis). Egy héttel később meghalt. A szülők AZT- (zidovudin) terápiában részesültek. A nő később szintén légzési elégtelenségben életét vesztette, míg a százados – magas HIV-antitest szintje ellenére – egyelőre tünetmentes maradt. highly active antiretroviral therapy – HAART a vírus életciklusának különböző pontjain különféle folyamatokra ható szerek kombinációja (proteáz inhibitorok, itegráz inhibitorok, „entry” inhibitorok, reverz transzkriptáz inhibitorok) lehetnek szinergista hatásúak is – kisebb dózis is elegendő, kevesebb mellékhatás

51 Speciális citométerek A számítógépek hatékonyságának, a képfeldolgozásnak és az adatátviteli sebesség növekedésének köszönhetően lehetségessé vált a citometria során megvizsgált sejtekről egyedi képeket készíteni. Morfológiai adatokhoz juthatunk az áramlási citométerrel is. Sejtfunkciók vizsgálatához hasznos lehet Lásd a következő ábrákon vagy a következő szemináriumokon.

52 Imaging cytometry, LSC (Részletesebb morfológiai információk)

53

54


Letölteni ppt "Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (2.) immunoblot immunhisztokémia áramlási citometria."

Hasonló előadás


Google Hirdetések