Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár."— Előadás másolata:

1 Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

2 , P 1 -P 1 ’ kötés: a hasadó kötés; P 6 -P 4 ’: szubsztrát hatóhelyek; S 6 -S 4 ’: a P 6 -P 3 ’ helyeknek megfelelő enzim hatóhelyek; P 6 -P 1 : a szubsztrát savkomponense (N-terminális rész); P 1 ’-P 4 ’: a szubsztrát aminkomponense (C-terminális rész); S 1 : az elsődleges specificitást meghatározó hely; P 1 : az S 1 helyet elfoglaló szubsztrát alegység. Schechter-Berger nómenklatúra P4’P4’ Enzim S5S5 S3S3 S1S1 S2S2 S1’S1’ S2’S2’ S6S6 P5P5 P3P3 P2P2 P2’P2’ P1’P1’ P6P6 P1P1 Hasadó kötés N C S3’S3’ S4’S4’ S4S4 P4P4 P3’P3’ Szubsztrát  Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

3 S1A proteinázok kötőfelszínei 189. pozíció S’ helyek Katalitikus triád S 2 helyek S 4 helyek S 1 helyek N-terminális domén C-terminális domén Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

4 Hatóhely preferenciák TripszinKimotripszin P4P4 P3P3 P2P2 P1P1 P1’P1’P2’P2’P4P4 P3P3 P2P2 P1P1 P1’P1’P2’P2’ Szerpinek AIP-SIITL-SA Kompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai -GP-I Aro. Hfb Ali. Hfb Acil-transzfer kísérletek adatai ----M Aro. Hfb ----R Ali. Hfb Peptid szubsztrát hasítóhelyek Hfb N S/A -S Kis Hfb Y/TR/T - T/A N Szerkezeti adatok Ali. Hfb X Hfb - Aro. Hfb Ali. Hfb X Hfb -+ Ali. Hfb „Konszenzus” Ali. Hfb Hfb Hfb/ P - Hfb / S Aro. Hfb Ali. Hfb T Hfb - +/S Ali. Hfb Hfb: hidrofób; Kis Hfb: kis hidrofób Ali.Hfb: alifás hidrofób; Aro.Hfb: aromás hidrofób +: pozitív töltésű S1A tagok általában P4P4 P3P3 P2P2 P1P1 P1’P1’P2’P2’ Szerpin statisztika Ali.Hfb Ali.Hfb/T Hfb/P -S Ali.Hfb Kompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai HfbHfb/P - S/Kis Hfb Hfb Acil-transzfer kísérletek adatai Peptid szubsztrát hasítóhelyek Ali.Hfb X Hfb/P - S/Kis HfbAli.Hfb Szerkezeti adatok Ali.Hfb X Hfb - Hfb/+Hfb „Konszenzus” Ali.Hfb HfbHfb/P - S/HfbHfb Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

5 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások Alapkövetelmények: 1.S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása 2.Kompetitív reakcióelrendezés Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

6 S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása A P’ kölcsönhatások hiánya miatt a kromogén szubsztrátok nem jöhetnek szóba. ↓ Az S1A enzim-szubsztrát kölcsönhatásokban általában szükséges és elégséges P 4 –P 2 ’ távolságot átfogó oligopeptid szubsztrát Kompetitív reakcióelrendezés ↓ Olyan oligopeptidek keveréke, melyek azonos aminosavakat hordozó „gerinccel” rendelkeznek, és csak a hasítóhelyen (P 1 pozíció) tartalmazzák a vizsgálandó specificitásoknak megfelelő aminosav oldalláncokat Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások

7 Analitikai módszer: 1.Optikai detektálás 2.Egyéb módszerek (HPLC, fehérje- szekvenálás, MS) Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

8 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások Optikai detektálás Egy lépéses egyszerű jelöléses vagy IFQ detektáláshoz egyelőre nem áll rendelkezésre kellő számú különböző csoport. ↓ Azonos jelölőcsoportot, vagy IFQ csoport párt tartalmazó szubsztrátok Az enzimatikus hasítás csak a komponensek elválasztása után lenne követhető. Egyéb módszerek Fehérjeszekvenálás: a reakcióelegy „pool” szekvenálása több analitikai buktatót is rejt. ↓ Megelőző analitikai HPLC Egyéb módszerek HPLC: a jelölt oligopeptidek alkalmazásához képest csökkent érzékenység ↓ A reakcióidő növelése Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

9 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások P 1 pozícióban a két archetípust, a tripszin és kimotripszin specificitást reprezentáló oldalláncok: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr és Leu P 1 pozícióban a HPLC elválasztás belső standardjaként az egyik komponens tartalmazzon inert aminosavat: Pro-t A közös szekvencia egyformán elfogadható vagy elfogadhatatlan mindkét archetípus és várhatóan a belőlük származtatható mutánsok, általában S1A proteinázok számára. P 1 ’ pozícióban nem tartalmazhatnak a szerin proteináz hidrolízisben kedvezőtlen, „tiltott” aminosavakat: prolint, savas oldalláncot. A közös szekvencia aminosavai nem szolgálhatnak jó hasítási helyként szerin proteinázok számára. Az oligopeptideknek oldhatóaknak kell lenniük fiziológiás körülmények között,  nem tartalmazhatnak az oldódást gátló hidrofób „magot”  lehetőleg tartalmazzanak az oldódást megkönnyítő hidrofil oldalláncokat. A peptidszekvenciákban ne legyenek olyan savas vagy bázikus „magok”, melyek a pH helyi megváltoztatása révén befolyásolhatják az enzimreakció lefolyását. Kerülendő olyan aminosavak beépítése, melyek problémát okozhatnak a szintézis vagy a tisztítási lépések során. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

10 Optimális közös peptidgerinc tervezése A közös P 4 -P 2 ’ mag tervezése P 1 pozíció: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Leu és Pro P 2 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: Pro P 3 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala P 4 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala P 1 ’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, átlagosan elfogadott: Ser P 2 ’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján kis hidrofób: Ala Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

11 Retenciós idő becslés A peptidkeverék komponensek retenciós időinek becslésére a következő képletet használtuk T r = B+A  D i n i Ahol T r a retenciós idő, D i : i aminosav oldallánc hozzájárulása a peptid retenciójához, n i : i aminosav száma a peptidben, A és B: a kromatográfiás rendszerre az oszlop, holttérfogatok, gradiens, és az eluensek által meghatározott állandók. AminosavGlyAlaValIleLeuPheTyrTrpMetPro D4,02,47,427,426,431,421,035,814,57,9 AminosavSerThrHisArgLysAspGluAsnGln D1,17,47,80,0-3,1-0,12,77,93,2 Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

12 Optimális közös peptidgerinc tervezése. A komponensek RP-HPLC elválasztásának hangolása. Retenciós idő hangoló tagok bevitele l épés peptid Rekker retenciós idő (T Rr ) ha X KRPYLFW Analitikai célú bővítés 2. N HAAPX 18,421,529,442,547,952,957,3 T HAAPXSA 21,925,032,946,051,456,460,8 C SA 3,5 A magszekvencia retenciós viszonyai 1. N AAPX 9,612,720,633,739,144,148,5 T AAPXSA 13,116,124,137,242,647,652 C SA 3,5 3. N HAAPX 18,421,529,442,547,952,957,3 T HAAPXSADI 49,252,360,273,378,783,788,1 C SADI 30,830,8 4. N HAAPX 18,421,529,442,547,952,957,3 T HAAPXSADIQI 79,882,990, , C SADIQI 61,4 5. N HAAPX 18,421,529,442,547,952,957,3 T HAAPXSADIQIDI 107,1110,2118,1131,2136,6141,6146 C SADIQIDI 88,7 Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

13 RP-HPLC körülmények beállítása A gradiens elúció sarokpontjai: Idő [perc]Összetétel [%B] Ekvilibrálás Injektálás023 Elválasztás Mosás Elválasztási körülmények Oszlop: Aquapore OD 300 (2,1 x 220mm) Áramlási sebesség: 300 ml/perc Injektálási térfogat: 5 ml Detektálás: 220 nm, 0,05 Full Scale Lehetséges adattartományok: A teljes szeparációs tartományt kihasználva adatgyűjtést végzünk az N-, és C-terminális peptidek és az intakt szubsztrátok retenciós tartományában. Az adatgyűjtést csak az N-, és C-terminális peptidek retenciós tartományában végezzük. Csak a C-terminális és az intakt peptidek retenciós tartományában gyűjtünk adatokat. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

14 Az enzimatikus emésztések reakciókörülményei A enzimreakciókat nyolc különböző enzimmel (szarvasmarha tripszin, kimotripszin, plazmin és trombin, egér endoproteináz Arg-C, patkány kimotripszin és mutáns tripszin (Tyrpszin), kecskerák tripszin) végeztük. Az enzimkoncentrációkat úgy optimalizáltuk, hogy összehasonlítható, közel azonos reakciósebességet eredményezzen a különféle enzimekkel végzett emésztésekben. A szubsztrátkeverék komponensek ekvimoláris elegyét a reakciópufferben (0,05 M TRIS-HCl, 18 mM CaCl 2 ) oldott egyedi oligopeptidek 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldataiból készítettük. A reakciókat 30 ml optimalizált koncentrációjú enzimoldat 670 ml szubsztrátkeverék-oldatba való pipettázásával indítottuk és 25 o C-on, 8-as pH-n vezettük le. Az emésztéseket különböző reakcióidőknél (0, 1, 4, 16, 32, 64 perc) 100 ml térfogatú alikvotok 20 ml 5 M-os ecetsavoldatba történő injektálásával állítottuk le. Peptidkeverék komponens szarvasmarhaegérpatkányrák tripszinkimotripszinplazmintrombinendoproteinázArg-CkimotripszinTyrpszintripszin c  M] 400,00120,00750,00120,0075 0,01500,15000,0012 Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

15 Patkány kimotripszin kromatogramserege 64 perc 32 perc 16 perc 4 perc 1 perc 0 perces állapot UV abszorbancia 220 nm-en Retenciós idő [perc] reakcióidő Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

16 A reproduktivitás ellenőrzése Abszorbancia 220 nm-en Tartalmú peptid szarvasmarha kimotripszin szarvasmarha tripszin Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

17 A szelektivitás ellenőrzése I. 16 perces állapotok összehasonlítása Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

18 A szelektivitás ellenőrzése II. 16 perces állapotok összehasonlítása Phe tartalmú peptid fogyására normalizált diagram Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

19 Szerin proteinázok tesztelése Csúcsterület csökkenés [%] 16 perces állapotok összehasonlítása


Letölteni ppt "Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével. Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár."

Hasonló előadás


Google Hirdetések