Enzimes hidrolízist a hidrolázok EC. 3.x.x.x végzik.

Az előadások a következő témára: "Enzimes hidrolízist a hidrolázok EC. 3.x.x.x végzik."— Előadás másolata:

1 Enzimes hidrolízist a hidrolázok EC. 3.x.x.x végzik.
észterázok: lipázok, foszfatázok glikozilázok, Peptidhidrolázok: proteázok, dezaminázok acilázok, stb X - Y + H2O HX + YOH vagy ? HY + XOH - 18OH

2 HIDROLÍZIS KEMÉNYÍTŐ ENZIMES HIDROLÍZISE AMILOLITIKUS ENZIMEK

3 ~80 μm klaszter kristályos Amorf növekedési gyűrű kristályos lamellák
amorf lamellák Amorf növekedési gyűrű kristályos ~80 μm klaszter

4 amilóz amilopektin Jódkeményítő színe: Polimerizáció
foka : >40 sötétkék 44 kék 25 bíbor 15 vörösesbarna 6 sárga Redukáló végek

5 HIDROLÍZIS C1 - O-   Amilolitikus enzimek, -amilázok,
-konfigurációjú lineáris és elágazó dextrineket képeznek a keményítő  -1,4-es kötéseinek hasítása révén. Extracelluláris és általában induktív enzimek, keményítőt statisztikusan támadják meg ( endoenzimek) a reakció eredménye eltérő polimerizációs fokú lineáris v elágazó dextrin. Sok gomba- és baktériumfaj termel. Ezek egymástól keményítő folyósító és/vagy elcukrosító hatásban, továbbá pH-, és hőmérséklet optimumban, valamint stabilitásban különböznek. A legtöbb  -amiláz stabilizátorként kalciumot igényel működése során. Bacillus subtilis, B.amyloliquefaciens, B.licheniformis, Aspergillus oryzae Thermomonospora C1 - O- OH  H 

6 HIDROLÍZIS A  -amilázok  -konfigurációjú maltózokat képeznek
-1,4-es kötések hasítása révén. exoamilázok jórészt növényi (maláta) eredetűek Ujabban mikroorganizmusok is: ezen  -amilázok hőmérséklet optimuma nagy, (sokkal nagyobb a maltózképződési sebesség!), nem igényelnek kalciumot a stabilizálásukhoz és aktivitásukhoz.

7 glüko-amilázok - vagy γ-amilázok
HIDROLÍZIS glüko-amilázok - vagy γ-amilázok amiloglükozidáz D-glükóz egységeket hasítanak le (exoenzimek) teljes keményítő molekula glükóz maltózt csak nagyon lassan bontják és nem támadják az elágazó láncok 1,6-kötéseit ill. csak nagyon lassan . glüko-amilázoknak kitett keményítő hasítási termékei: glükóz, maltóz és határdextrinek keverékei. Enzim előállítása: Aspergillus, Rhisopus törzsek Pullulanázok ill. izoamilázok az amilopektin elágazó oldalláncait -1,6-kötéseit képesek hasítani

8 NR R ……. NR=nemredukóló vég R=redukáló vég határdextrin α-amiláz β-amiláz amiloglikozidáz pullulanáz

9 pH 5,5-5,7

10

11

12

13 cellulóz hidrolizis 1β 4 n cellobióz Redukáló vég Nemredukáló vég

14 A lignocellulózok szerkezete
EM Rubin Nature 454, (2008) doi: /nature07190

15 Trichoderma reesei celluláz készitményei 3 enzim keverékét tartalmazzák:
Endo-1,4- β-glucanase Exo-1,4-β-glucosidase exo-cellobiohydrolase glükóz cellobióz + cellobiáz R NR (EC ) (EC ) (EC ) (EC )

16 N-acetil-D-glükózamin β- (1,4) homopolimer
Kitin és kitinázok N-acetil-D-glükózamin β- (1,4) homopolimer Serratia marcescens kitináz állatok feldolgozásából eredő hulladékok degradációja biokontroll, pl.moszkitó

17 PEKTIN HIDROLÍZIS n m galakturonsav Pektin fő szerkezete

18 Pektin tényleges szerkezete

19 HIDROLÍZIS PEKTIN HIDROLÍZIS α-1,4-galaktozidkötések
pectin lyase (EC ), endopolygalacturonase, EC exopolygalacturonase, EC pectinesterase EC

20 Kereskedelmi pektolitikus enzimek (keverék) gyümölcsléderitéshez:
a.polygalacturonase (EC ), a 1,4-α-D-galactosiduron-kötés statisztikus bontása b.pectinesterase (EC ), methanolt hasit le a pektin metil-észterről, c.pectin lyase (EC ), amely oligoszaharidokat szabadit fel, nemredukáló véggel (((d. hemicellulase (keverék, amelyben: xylan endo-1,3-β-xylosidase, EC ; xylan 1,4-β-xylosidase, EC ; α-L-arabinofuranosidase, EC ), ))) optimális a pH rendszerint 50°C alatt.

21 laktóz galaktóz glükóz
Laktóz 4.7 s% a tejben és a savóban (sajtgyártás) A felnőtt populáció zöme laktóz intoleranciában szenved csecsemők toleránsak, később elvész Kina: 90%, Fekete amerikaiak: 73% intoleráns fehér USA: 96%-a, svédek 84%-a toleráns Laktóz hidrolizis: LAKTÁZ : β-galactosidase (Exo-(1→ 4)-beta-D-galactanase,lactase EC ) Laktóz hidrolizis Transzferáz aktivitás is β-galaktozidáz laktóz galaktóz glükóz Laktóz bontatlanul vastagbélbe Vizleadás hasmenés Bélbacik gázképződés explozív diarrea

22 Origin pHopt. Topt Km (mM) lactose* M, kDa Activator Inhibitor Fungal Aspergillus niger 3.5 58 85 124 Aspergillus oryzae 5.0 55 50 90 Yeast Kluyveromyces lactis, K.fragilis 6.5 37 35 115 K+, Mg2+ Ca2+, Na2+, Zn, Cu Bacterial E. coli 7.2 40 2 540 Na+, K+ B. subtilis 700 B. stearothermophilus 6.2 220 Mg2+ L. thermophilus 6

23 Tejipari élesztő Kluyveromyces fragilis (K. marxianus var. marxianus),
pH optimum (pH ) vagy Aspergillus oryzae vagy A. niger, pH optimum (pH and ) termék inhibició a galaktóz által Laktázok felhasználása: fagylalt, izesített és natúr kondenztejkészitmények (2000 U kg-1) enzim egy nap 5°C-on, kb. 50%-a a laktóznak lebomlik ami édesebb és nehezebben kristályosodó lesz! Kisebb mennyiségben a hosszan eltartható sterilezett tejekhez is adnak (20 U kg-1, 20°C). Ma még nagyon drága

24 Penicillin hidrolízis
Sir A.Fleming

25 A penicillin egy irreverzibilis suicide inhibitor
CH 3 COO - H C O Strained peptide bond Penicillin R Feszített peptid kötés N S CH 3 COO - H C O R glycopeptide glycopeptide transpeptidase transpeptidase OH O Ser Ser A glikopeptid transzpeptidáz katalizálja a keresztkötés képződést a baci sejtfal D-aminosavjai között. Természetesen a fordított reakciót, azaz a peptid kötés bontását is katalizálja! Miközben hidrolizálja a penicillin β–laktám gyűrűjének feszített peptidkötését, maga aktiválja a saját inhibícióját: kovalensen kötve marad a szerin OH csoportja, azaz az enzim öngyilkosságot követ el.

26 HIDROLÍZIS penicilloin-sav 6-amino-penicillánsav V-penicillin
penicillináz Penicillin-aciláz b -laktám gyűrű H C 2 N O S tiazolidin gyűrű fenilecetsav C H 2 N O S HOOC N H 2 O S C penicilloin-sav 6-amino-penicillánsav 6-APA 6-APS OC H 2 C O V-penicillin fenoxiecetsav C H NH 2 O ampicillin C O OCH 3 meticillin

27 HIDROLÍZIS Penicillin enzimes hidrolízise

28

29 penicillin aciláz (EC 3.5.1.11)eredetileg penicillin-amidáz
HIDROLÍZIS penicillin aciláz (EC )eredetileg penicillin-amidáz E.coli Inaktivált sejtek, szakaszos reaktor LÍZIS Rögzített élő sejtek (CSTR) v. Oszlopban SZENNYEZETT KINYERT/RÖGZÍTETT PENICILLINACILÁZ E.coli FERM cf t1/2=2-3 hónap sejtfeltárás IMMOBILIZÁLÁS debris Kisózás 1 TISZTÍTÁS NS enzim Kisózás 2 nagynyomású sejtfeltáró

30 HIDROLÍZIS REAKCIÓ TULAJDONSÁGAI: S és P inhibíció
pH csökken termékbomlás pH-szabályozás problémái oszlopreaktorban CSTR Toyo-Ozo Kicsapás izoelektromos ponton, szűrés, mosás, szárítás

31 HIDROLÍZIS Toyo-Ozo eljárás: recirkulációs LÚG CSTR 30 liter 18 3 2 1
6000 l/h 30 óra ciklusidő 33 kg/m3h produktivitás 86%

32 95% konverzió optimális a 4 sorbakötött reaktor
3 5

33 Phe-Gly Penicillinaciláz Szintézisre is!!! 7-amino-deacetoxi cefalosporánsav

34 HIDROLÍZIS RNS-hidrolízis 5'-IMP 5'-UMP 5'-CMP 5’-GMP
Ízfokozók Na-glutamát De novo fermentáció Élesztő RNS hidrolízise RNS extrakció NaCl oldattal 100 oC-on Kicsapás EtOH/HCl Hidrolízis Pen.citrinum A.oryzae P1 nukleáz dezamináz (endo+exo) S. Cerevisiae C.utilis RNS 5'-GMP 5'-UMP 5'-CMP 5'-IMP 2% oldat, 65oC p H=5 4 óra foszfatáz 5'-AMP kromatográfia

35 FOSZFORILEZÉS ATP és ADP előállítás

36 ATP FOSZFORILEZÉS AMP ADP + Fruktóz-1,6-diP élesztő Mg
N O C H 2 + Fruktóz-1,6-diP élesztő Mg 2+ Kína: 300 dm3 reaktorban, 25 t élesztő, 5 t ATP ATP + glükóz Gl-6-P + ADP Sok élesztő Rövid kontaktidő Leállítás: savazás

37 FOSZFORILEZÉS