Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina."— Előadás másolata:

1 1 Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina

2 2 Bevezető A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt. –Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon), –ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében) –CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz függvényében) Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik.

3 3 Optikailag aktív, királis anyag Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe). –Arago, kvarckristály (1811) –Biot, borkősav vizes oldat (1838) –Pasteur, aszimmetria – optikai aktivitás ( ) –Kekulé ( ), Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése). Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív

4 4 Enantiomerek (1) Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk; „ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak). Szimmetrikus környezetben: azonos fizikai és kémiai tulajdonságok Aszimmetrikus környezetben: különböző tulajdonságok. Királis molekulák egymáshoz való viszonya

5 5 Enantiomerek (2) Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum. A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül: –Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik –Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl. diasztereomer képzés, rezolválás alapja) –„Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja eltér. Epimerek: csak egy aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja más)

6 6 Kiralitás fajtái Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás Helikális kiralitás

7 7 A fény polarizációja Az elektromágneses sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált. x y z Nem polarizált fény Síkban polarizált fény

8 8 Síkban polarizált fény előállítása Polarizálatlan fény A vertikálisan polarizált komponens átjut. A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn). A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).

9 9 A lineárisan polarizált fény két cirkuláris komponense

10 10 Optikai forgatás A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve. n bal ≠n jobb Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át. n=c/v Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul (  szöggel).

11 11 Optikai forgatás (2)

12 12 Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon /589nm (Na D- vonal)/

13 13 Optikai forgatás Általában specifikus forgatásként van megadva [  ], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva). Megadása: [  ] D 25 = +65° (c=1.0, EtOH) +, óramutató járásával megegyező irány –, óramutató járásával ellentétes Tisztaság meghatározás: –Mért specifikus forgatás*100 specifikus forgatás (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

14 14 Optikai rotációs diszperzió (ORD) Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében) Polikromatikus fényforrás Detektor: fotoelektron sokszorozó

15 15 ORD spektrum Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés). Kromofórt tartalmazó királis minta esetén ún. Cotton effektus (anomália) rakódik a plain curve-re, ott ahol a minta elnyel. A csúcs és a vályú közti metszéspont hullámhossza jól egyezik az abszorpciós max –al..

16 16 Cirkuláris dikroizmus

17 17 Cirkuláris dikroizmus (2) A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) különböző mértékben nyelődik el (abszorbeálódik) királis mintán áthaladva. Lineárisan polarizált fényElliptikusan polarizált fény Összegük:

18 18 CD spektrum A CD spektrumban  A-t,  -t (egyezményesen  bal -  jobb ) tüntetik fel a hullámhossz függvényében. (néha az ellipticitást (  ), a moláris ellipticitást [  ]) A bal  A jobb  A /c·l (  A=A bal -A jobb )  =  bal -  jobb = nm, e - gerjesztés AA A jobb A bal

19 19 Enantiomerek CD spektruma  jobb,(R) =  bal,(S),  bal,(R) =  jobb,(S)  bal, (R) -  jobb,(R) =  (R) =  jobb, (S) -  bal,(S) =  (S)  bal, (S) -  jobb,(S) =  (S) =  jobb, (R) -  bal,(R) =  (R) TÜKÖRKÉPI VISZONY

20 20 CD mérés (spektropolariméter) CDM (CD modulátor, fotoelasztikus modulátor): Felváltva állít elő jobbra és balra cirkulárisan polarizált fényt Minta (királis) Detektor: Fotoelektron sokszorozó LS (light source) M (mirror), S (slit), P (prism), SH (shutter) L (lens), F (filter)

21 21 Ahol az optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus. Ahol az anyag nem nyel el: nincs CD jel, ORD-ben plain curve. UV, ORD, CD összefüggése

22 22 A CD spektroszkópia alkalmazásai Enantiomertisztaság meghatározás Abszolút konfiguráció meghatározás Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés tanulmányozása). Fehérjék tanulmányozása: másodlagos szerkezet, konformációs változások

23 23 Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). A racém részen felüli túlsúly.

24 24 Enantiomertisztaság meghatározás CD (koncentráció független) Anizotrópia-faktor (g-faktor): –A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása. –Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.

25 25 Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?] Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős

26 26 Racémként hozták forgalomba A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. Célcsoport: állapotos nők. Feltűnően sok gyermek született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg visszamaradottan. Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide)

27 27 (R)-izomer(S)-izomer teratogén hatású hatékony szedatívum

28 28 Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor. Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.

29 29 Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyület  hasonló, ismert térszerkezetű vegyület. (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály) (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért spektrummal.

30 30 Példa (1) (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció Ismeretlen abszolút konfiguráció Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció

31 31 Oktáns szabály (ketonokra) (2) Adott molekula- geometriához meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmeneté hez tartozó CD jel előjele. A molekula 3D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil csoport felezőpontja a 3 tengely metszéspontjával egybeessen. Amely térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv.

32 32 Oktáns-szabály alkalmazása (2) Oktáns projekciós diagram (-) (+) (-) (+)Az atomok túlnyomó része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez negatív karbonil sáv tartozik. (Tengelyre eső atomok hozzájárulása 0).

33 33 Oktáns-szabály alkalmazása (2) 11b 2 stabil konformációban létezik, az egyikre negatív a másikra gyenge pozitív karbonil jelet jósol. Összegük: gyenge negatív jel (+) (-) (+)

34 34 Oktáns-szabály alkalmazása (2) Pozitív Cotton effektus = Pozitív CD jel ORD spektrum (specifikus forgatás a hullámhossz függvényében) Negatív Cotton effektus = Negatív CD jel

35 35 Indukált CD Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS) Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az e - átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának a királishoz kötődve CD-jele indukálódik.

36 36 Indukált CD A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik. A látható tartományban (cisz-parinársav elnyelési tartományában) CD jel indukálódik cisz-parinársav (kromofór, akirális vendégmolekula)  -laktoglobulin (királis host, látható tartományban nincs elnyelése)

37 37 Indukált CD 2 db akirális festékmolekula kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún. exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula kötödik egy fehérjekötőhelyen). Egyre több festékmolekulát hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési tartományában jelentkezik.

38 38 Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait. A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok, fehérjekötődési vizsgálatok).

39 39 Másodlagos szerkezet Fehérjék esetében a távoli UV tartományban (180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet nm közt a CD spektrum az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet, más a CD spektrum.

40 40 Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma Ebben a tartományban ( nm) adott fehérje CD spektruma a „tiszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineárkombinációjaként írható.  -hélix rendezetlen szerkezet  -redő  -turn

41 41 Lineárkombináció  -hélix rendezetlen szerkezet  -redő Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

42 42 Illesztés Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék. (Programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak).

43 43 Eredmény Másodlagos szerkezetek A mért CD spektrum alapján megkapjuk a vizsgált proteint alkotó másodlagos szerkezetek százalékos arányát.

44 44 rendezetlen szerkezet  -hélix  -redő rendezetlen szerkezet  -redő Mivel a három alap konformáció (  -hélix,  -redő, rendezetlen szerkezet) CD spektruma igen különbözik egymástól, kis, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban.

45 45 A ribonukleáz hődenaturációja Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on. Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).  -hélix rendezetlen szerkezet

46 46 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "1 Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina."

Hasonló előadás


Google Hirdetések