Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Pécs, 2006.09.27. 1 Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Pécs, 2006.09.27. 1 Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam."— Előadás másolata:

1 Pécs, Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam

2 Pécs, /58 Kromatográfia (1903) Михил Цвет (Ultra)centrifugálás (1908 / 1926) Theodor Svedberg Elektroforézis (1930 / 1948) Arne Tiselius Tömegspektrometria (1897) Elválasztástechnika

3 Pécs, /58 Tiselius elektroforézis készüléke

4 Pécs, /58 Gélelektroforézis (urea jelenlétében) Vasmentes és vassal telített transferrin minták. 6%T, 3%C; 100 V, 8°C. Futtatási idő 17 óra.

5 Pécs, /58 Zónaelektroforézis kapillárisban urea jelenlétében ---

6 Pécs, /58 A kapilláris elektroforézis kezdete Stellan Hjertén (1958) - „free zone electrophoresis” 1-3 mm kvarccső Franz Everaerts (1970-es évek eleje) – ITP (Kendall, 1923!) Rauno Virtanen (1974) - potenciometrikus detektálás, ZE F.E.P. Mikkers (1979) - zónaelektroforézis tefloncsőben J. Jorgenson (1981) - zónaelektroforézis, EOF !

7 Pécs, /58 Elektroforetikus rendszer Hjertén, 1958

8 Pécs, /58 „Free zone electrophoresis” (Stellan Hjertén, 1967)

9 Pécs, /58 Az első „kapilláris elektroforézis” készülék Stellan Hjertén, 1967

10 Pécs, /58 A vándorlás sebessége elektromos térben vsebesség  mozgékonyság, mobilitás (mobility) Eelektromos térerő Ualkalmazott feszültség laz elválasztó rendszer (ellenállással rendelkező) hossza

11 Pécs, /58 Elektromos mozgékonyság (mobility) Elektroforetikus vándorlás ideális (híg) oldatokban A vándorlás a töltés/tömeg hányadostól és a viszkozitástól függ

12 Pécs, /58 oldat  papír  gél  oldat Az elektroforézis közege

13 Pécs, /58 A poliakrilamid mátrix előnyei majdnem teljesen ideális, áramlásmentes közeg felbontó képessége nagy a diffúzió csökkentett viszonylag éles zónákban történik a komponensek vándorlása

14 Pécs, /58 A szabad oldatban történő elektroforézis előnyöket eredményez, de „következményekkel jár” elektroendozmózis

15 Pécs, /58 Az elektromos kettősréteg az üveg felületén

16 Pécs, /58 Kettős réteg elektródok felületén kolloid részecskék felületén

17 Pécs, /58 Az endozmótikus áramlás mozgékonysága a vákuum dielektromos állandója az oldószer dielektromos állandója viszkozitás „zéta potenciál”

18 Pécs, /58 Elektroendozmótikus áramlás (endosmotic flow)

19 Pécs, /58 Az áramlási profil hatása a zóna-szélességre A kialakuló folyadékáram dugószerű profilt mutat.

20 Pécs, /58 Az endozmózis függése a pH-tól

21 Pécs, /58 Kationok és anionok vándorlása elektroozmózis jelenlétében [cm 2 V -1 s -1 ] (1 Tiselius egység = cm 2 V -1 s -1 )

22 Pécs, /58 Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében - + EOF

23 Pécs, /58 Pozitív, semleges és negatív komponensek elektroforézise Benziltrimetilammónium kloridot (1), benzil-alkoholt (2), acetilszalicilátot (3), 4-hidroxibenzoátot (4) és benzoátot (5) tartalmazó mintaoldat elektroferogramja (Körülmények: kapilláris: 57 cm x 75 μm, térerősség: 263 V/cm, T=25  C, =200 nm, puffer: 50 mM foszfát, pH=7,0.)

24 Pécs, /58 Fedett kapillárisban a gélelektroforézishez hasonló körülmények „Coated capillary” Metilcellulóz Nem keresztkötött poliakrilamid Szénhidrátok AZ EREDMÉNY  nincs elektroendozmózis !

25 Pécs, /58 A kapilláris elektroforézis gyakorlata Automatizálható A kapillárist „kondícionálni” kell/lehet Kapilláris bevonat alkalmazható („coating”) Mintabevitel többféle módon lehetséges A tápegység detektorhoz közel eső pólusa földelt Változatos futtatási körülmények (környezeti paraméterek) puffer-adalékok Többfajta elválasztási elven működő rendszer Változatos detektálási módszerek (egy ponton, teljes hosszban) Kiértékelés, kalibráció

26 Pécs, /58 A kapilláris elektroforézis készülék  m „fused silica” kapilláris Állandó hőmérséklet ( °C) UV detektor Nagyfeszültségű tápegység 0-30 kV Minta és elektrolit-tartályok

27 Pécs, /58 Kapilláris elektroforézis (1995)

28 Pécs, /58 Chip-kapilláris elektroforézis készülék (2005)

29 Pécs, /58 Kvarc-kapilláris és mikrochip

30 Pécs, /58 A detektálási módszerek érzékenysége Direkt módszerek UV-látható fényelnyelés mol Fluoreszcencia mol Lézer-indukált fluoreszcencia (LIF) mol Amperometria mol Vezetőképesség mol Tömegspektrometria mol

31 Pécs, /58 Osztályozás az elválasztás elve alapján Az elektroforézis módszerei

32 Pécs, /58 Az elektroforetikus elválasztás fajtái (1) Zóna elektroforézis (ZE - CZE) Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF) Izotachoforézis (ITP - CITP) Gélelektroforézis (PAGE - CGE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján előre megformált pH gradiensben A vándorló komponensek mobilitása (  ) alapján SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján

33 Pécs, /58 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) Az elektroforetikus elválasztás fajtái (2) A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján Az elektroendozmózis jelenlétében vándorló komponensek és a kromatográfiás álló fázis kölcsönhatása alapján

34 Pécs, /58 Zóna elektroforézis (ZE - CZE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján történő elválasztás Megfelel a nem-denaturáló gél-elektroforézisnek

35 Pécs, /58 Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében - + EOF

36 Pécs, /58 Szérum-elektroforézis Normál szérum kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 70.6 g/l, albumin-tartalom 42.7 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 20 kV; 200 nm, 20 °C. A minta higítási aránya 1:50.

37 Pécs, /58 Liquor-elektroforézis Normál liquor kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 0.42 g/l, albumin-tartalom 0.23 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 25 kV; 200 nm, 20 °C. A minta nem volt higítva.

38 Pécs, /58 Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF) Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján, előre megformált pH gradiensben történő elválasztás

39 Pécs, /58 pH gradiens formálása amfolitokkal amfoter tulajdonság szintetikus vegyületek keveréke (> 4000 féle molekula különböző izoelektromos ponttal) jó pufferkapacitás >0 vezetőképesség az izoelektromos pontnál

40 Pécs, /58 Izoelektromos fókuszálás (isoelectric focusing)

41 Pécs, /58 Transzferrin-formák detektálása 280 nm-en a fehérjemennyiség detektálható, 460 nm-en a vassal telített fehérjemennyiség detektálható Az egyes transzferrin izoformák izoelektromos pontja közötti különbség kisebb, mint 0.3 pH egység

42 Pécs, /58 Hemoglobin formák analízise izoelektromos fókuszálással normál Hb minta Hb minta diabéteszes betegtől Hb variánsok

43 Pécs, /58 Izotachoforézis (ITP - CITP) A vándorló komponensek mobilitása (  ) alapján történő elválasztás

44 Pécs, /58 Izotachoforézis (isotachophoresis) A vándorló komponensek a mobilitásuknak (  ) megfelelő sorrendben vándorolnak az elválasztás után (azonos sebességgel)  záró-ion <  C-komponens <  B-komponens <  A-komponens <  vezető-ion

45 Pécs, /58 Uraemiás beteg széruma izotachoforetikus koncentrálás nélkül nem vizsgálhatók a kóros mennyiségben felgyülemlő savak

46 Pécs, /58 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján, azaz a molekulák hidrofóbicitása alapján történő elválasztás

47 Pécs, /58 Micellaképződés A felületaktív anyagok egy bizonyos koncentráció-érték felett micellákat képeznek. CMC - kritikus micella koncentráció (c SDS = 8 mM) „SDS” - > a dodecil-szulfát anionok micellákat képeznek, amelyekben a poláris oldószer felé helyezkednek el a szulfát-anion csoportok, és a micella magját az apoláris, hidrofób láncok alkotják

48 Pécs, /58 Micellar elektrokinetic chromatography (Shigeru Terabe, 1985) Micellákat tartalmazó elektrolitban a micellába belépő hidrofób komponensek, hidrofóbicitásuknak megfelelően rövidebb-hosszabb ideig a micellával együtt vándorolnak az elektromos térben.

49 Pécs, /58 Töltéssel nem rendelkező anyagok elektroforetikus/elektrokinetikus analízise A dodecil-szulfát micellák segítségével 14 mono- és diszaccharid elválasztása lehetséges nagy felbontással, mennyiségi analízis céljára is. A cukrok jelölve voltak a detektálhatóság érdekében

50 Pécs, /58 Gélelektroforézis (PAGE - CGE) Miután a kapillárisban nem szükséges hordozó mátrix, ezért a gélelektroforézist csak az ún. denaturáló formában alkalmazzuk molekulasúly meghatározásra, vagy DNS analízisre. Fehérjéket SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján lehet elválasztani a gél-pórusokon való átvándorlás akadályozottsága miatt Nukleinsavakat / oligonukleotidokat is molekulaméret szerint választhatunk el

51 Pécs, /58 Gélelektroforézis Alkalmazott mátrixok és polimer hálózatok agaróz keresztkötött poliakrilamid gél nem keresztkötött poliakrilamid kolloid oldata hidroxietil-cellulóz (HEC) hidroxipropil metil-cellulóz (HPMC) metil-cellulóz (MC) polivinil-alkohol (PVA) dextrán polietilén-glikol (PEG és polietilén-oxid (PEO) polivinilpirrolidon (PVP)

52 Pécs, /58 Agaróz gél

53 Pécs, /58 Poliakrilamid gél

54 Pécs, /58 Lineáris polimerek használata elválasztásra

55 Pécs, /58 Polimer hálózatokon keresztül történő vándorlás ugyanúgy „akadályozott”, mint egy keresztkötött gél esetében, tehát a molekula méretétől függ Polimer oldatok alkalmazása automatizálhatóvá teszi a gél- elektroforézis

56 Pécs, /58 A dodecil-szulfát láncok hatása fehérjemolekulákra és kölcsönhatása a molekulákkal A fehérjemolekulák az SDS oldatban denaturálódnak és egyúttal a dodecilszulfát láncok a polipeptidlánchoz egyenletes „eloszlásban” hozzátapadnak. Ennek következtében a különböző polipeptidláncok mobilitása azonos lesz, mert egy kétszer olyan hosszú polipeptidlánchoz kétszer annyi dodecilszulfát lánc kötődik, így a z/m azonos lesz! Megjegyzések A teljes denaturációhoz a diszulfidhidak felbontása is szükséges! Ezt redukálószerekkel lehet elérni.) A polipeptidlánc „saját” töltését a nagy negatív töltés „eltakarja”!

57 Pécs, /58 Fehérje-molekulasúly standardok polimer oldaton történő elektroforézise Fluoreszcens detektálás a dodecilszulfát láncokhoz kötődő fluoreszcens festékkel Bioanalyzer 2100 (Agilent)

58 Pécs, /58 Polinukleotid elektroforézis A nukleinsavak töltés/tömeg-aránya gyakorlatilag azonos! Mobilitásuk „szabad”-oldatban azonos!

59 Pécs, /58 DNS láncok vándorlása gélszűrő hatás esetén

60 Pécs, /58 Oligonukleotidok gél-elektroforézise

61 Pécs, /58 DNS szekvenálás elektroforézissel Maxam-Gilbert módszerSanger módszer GTCGATCG….. CTGGACTGT...

62 Pécs, /58 DNS szekvenálás kapilláris elektroforézissel (genomics) a szekvencia közvetlenül leolvasható az elektroferogram-sorozatról a négyféle „színű” jelöléssel, az egymásra vetített elektroferogramok közvetlen információt adnak

63 Pécs, /58 Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) Az elektroendozmózis jelenlétében vándorló komponensek és a kromatográfiás álló fázis kölcsönhatása alapján történő elválasztás

64 Pécs, /58 Kapilláris elektrokromatográfia

65 Pécs, /58 A vándorlást a kapilláris fal mentén, és az állófázison kialakuló elektroendozmózis biztosítja! Kapilláris elektrokromatográfia

66 Pécs, /58 Kapilláris elektrokromatográfiás álló fázisok Az álló fázist vagy betöltjük a kapillárisba, vagy - in situ - a kapillárisban hozzuk létre a monomer oldatok beinjektálása után. A szelektivitást az álló fázishoz kötött ligandumokkal (pl. CD, fehérjék, stb.) lehet változtatni

67 Pécs, /58 Elektrokromatogram. Minta: cytochrome c tripszines emésztés után. Kisérleti körülmények: izokratikus elválasztás 25° és 55° fokon. Oszlop: 75 μm i.d. fused silica kapilláris, 30 cm, mozgó fázis: 40% acetonitrile, 50 mM foszfát puffer, pH 2.5; 230 kV; 214 nm/UV detektálás.

68 Pécs, Alkalmazások

69 Pécs, /58 Kapilláris zóna-elektroforézis szérum-elektroforézis / liquor / follikulus folyadék Kapilláris zóna-elektroforézis adalékanyag jelenlétében királis elválasztások ciklodextrinekkel királis elválasztás fehérjékkel affinitás elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Gél-elektroforézis fehérje-profil analízis bakteriális fehérjék külső membrán-fehérjék Gél-elektroforézis chip-technikával „Cell-sorter” chip-technikával

70 Pécs, /58 Myeloma multiplex, sclerosis multiplex

71 Pécs, /58 Szérum-elektroforézis A módszer rutin-technika, egyszerre több kapillárisban

72 Pécs, /58 MegaBace - 96 minta egyidőben

73 Pécs, /58 MegaBace kapillárisok

74 Pécs, /58 Királis elválasztás kapilláris elektroforézissel Ciklodextrin befogadó gyűrűvel a vándorlási sebesség megváltozik, az enantiomerek egymástól elválnak

75 Pécs, /58 Enantiomerek elválasztása Hexobarbitál enantiomerek elválasztása fedett és kezeletlen kapillárisban

76 Pécs, /58 CEC és HPLC ligand-kicserélődéssel D,L Phe elválasztása hidroxiprolin-származék oszlopon CEC „continuous bed” HPLC CEC + nyomás Electrophoresis 21 (2000)

77 Pécs, /58 Triptofán-származékok elválasztása zóna-elektroforézissel triptofán metil-észter TME, triptofán etil-észter TEE triptofán butil-észter TBE

78 Pécs, /58 Háttérelektrolit: 10 mM MES, pH 6 fedett („coated”) kapilláris pI (Tf) = 6 Vándorlás elektromos térben egy fehérje zónán keresztül a transzferrin zóna nem vándorol minta minta transzferrin Kapilláris elektroforézis transzferrin jelenlétében

79 Pécs, /58 A triptofán-észterek két-két komponensre válnak szét Transzferrin jelenlétében az enantiomerek elektroforetikus vándorlása különbözik egymástól, amely specifikus kölcsönhatásra utal

80 Pécs, /58 TME TEE TBE mm Zónahossz Az elválasztás mértéke függ a transzferrin zóna hosszától

81 Pécs, /58 Labetalol optikai izomerek elválasztása modellezéssel a kötőhelyek feltérképezhetők

82 Pécs, /58 Fehérjék és endotoxinok kölcsönhatása A lipopoliszaccharidok a fehérjékkel való kölcsönhatás alapján „láthatók”. A különböző komplexek jellemző elektroferogramot adnak endotoxinhemoglobin endotoxin – hemoglobin komplex 0 h 2 h

83 Pécs, / „Chip”-ek RNA 6000 Nano LabChip DNA 1000 LAbChip Protein 200 Plus LabChip Cell Fluorescence LabChip

84 Pécs, /58 A kapilláris elektroforézis nagy kalandja

85 Pécs, /58 Injektálás chip-en

86 Pécs, /58 Többszörös analízis, reakciók alkalmazása

87 Pécs, /58 Baktériumok fehérje-profilja gél-elektroforézissel molekulasúly szerinti elválasztás folyamatos detektálás fluoreszcens festék alkalmazásával több minta egymás utáni elválasztása gyorsan összehasonlító kiértékelés

88 Pécs, /58 Fehérje-profil analízis Pseudomonas aeruginosa NIH Hungary törzs fehérje-profilja kapilláris chip elektroforézissel molekulaszűrő polimer oldaton keresztül vasat tartalmazó és vasat nem tartalmazó táptalajon való tenyésztés után

89 Pécs, /58 Összehasonlító analízisek standardizált körülmények között IgG minták és standard fehérjekeverékek (teljes analízisidő: 30 perc)

90 Pécs, /58 Gél-kép konverzió A számítógép által konvertált kép / a standard fehérjék azonos pozícióban!

91 Pécs, /58 Baktériumok fehérje-profilja

92 Pécs, /58 Sejt-analízis chip-en

93 Pécs, /58 CE - MS Electro-spray ionization


Letölteni ppt "Pécs, 2006.09.27. 1 Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam."

Hasonló előadás


Google Hirdetések