Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

2D gélelektroforézis a proteomikában. Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME”(Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "2D gélelektroforézis a proteomikában. Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME”(Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról."— Előadás másolata:

1 2D gélelektroforézis a proteomikában

2 Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME”(Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Térben és időben dinamikusan változik A proteomika a proteomok jellemzésével foglalkozó tudományág.

3 Új információk nyerhetőek a különböző állapotú sejtek, organizmusok fehérjekészletének összehasonlításával. - stressztoleranciáért felelős fehérjék - virulenciáért felelős fehérjék - rezisztenciáért felelős fehérjék - betegségek kialakulásáért felelős fehérjék - transzkripciós faktorok célgénjeinek terméke Vizsgálata: Két-dimenziós gélelektroforézis + tömegspektrometria Kvantitatív tömegspektrometria

4 Miért 2D gél? A proteomok nagyon komplexek (ember:~ fehérje), ezért szükség van egy elválasztási technikára ami: reprodukálható nagy felbontású (1D-kb. 100 fehérjesáv, 2D kb spot) megengedi a minták kvantitatív összehasonlítását megengedi a poszt-transzlációs módosítások detektálását

5 Mi az a 2D gél? Az első és második dimenziós elválasztás különböző „molekuláris tulajdonság” alapján történik: Első dimenzió = izoelektromos pont - izoelektromos fókuszálás Második dimenzió = molekula tömeg - SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid- gélelektroforézis)

6 Mintaelőkészítés Izoelektromos fókuszálás SDS PAGE Festés és vizualizáció Gélképek analízise Spotok kivágása MS Fehérjék azonosítása

7 Mintapuffer A legtöbb mintapuffer a következő összetevőket tartalmazza: denaturáló szerek nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek redukáló szerek carrier amfolitok brómfenolkék

8 Mintaelőkészítés Izoelektromos fókuszálás

9 A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően Izoelektromos pont: ezen a pH érteken a fehérje töltése nulla Izoelektromos fókuszálás pH 3pH 10

10 Strip-ek Egy kis történelem…… Patrick O’Farrell: 1975, J Biol Chem 250, gél rúd „mobil” pH gradiens rossz ismételhetőség nehéz kezelhetőség Az első

11 1982, J.B.B.M. 6: Rögzített pH gradiens Még mindig nehezen kezelhető 1988, Electrophoresis, vol 9, p 531 A gél fóliára rögzítése Könnyen kezelhető Reprodukálható Pier Giorgio Righetti

12 Strip-ek A pH gradienst tartalmazó nagyon lágy (4%) gél egy vékony fóliához van polimerizálva és rászárítva Sokféle pH gradiens (Pl.: 3-10, 4-7, 5-8, 9-11) Számos méret (7, 11, 17, 18, 24 cm) Néhány cégnél lehet a szokásostól eltérő pH tartományú, hosszúságú strip-et rendelni

13 Izoelektromos fókuszálás Tálcákban történik A stripek olajjal vannak lefedve Limitált áramerősség mellett (50 µA) Magas feszültség mellett ( V, 17 cm-es stripnél) 20 O C-on Általában optimalizálni kell a futtatási időt

14 Mintaelőkészítés Izoelektromos fókuszálás SDS PAGE

15 SDS-PAGE A fehérjéket „beburkoljuk” SDS-el (anionos detergens) ezáltal egységesen negatív töltést kapnak A fehérjék az anód felé törekszenek, ha elektromos mezőbe helyezzük őket A fehérjék mozgása a gélben csak a relatív molekula- tömegüktől és az alkalmazott gél pórusátmérőjétől függ

16 Strip ekvilibrálás Az elsődleges cél, hogy a fehérjéket SDS-el beburkoljuk Egyéb célok: a strip teljes hosszában egységessé tenni a pH-t (1,5 M Tris puffer, pH 8.8) redukálni (újra) és alkilálni a cisztein oldalláncokat, ezért két lépcsőben történik az ekvilibrálás: redukálás DTT-vel, a visszaalakult kén hidak megszüntetése a cél

17 alkilálás jódecetsavval, a redukált cisztein oldalláncok végleges módosítása a cél, de a maradék DTT/DTE is elreagál a jódecetsavval, ezért a redukáló szerekhez képest 3-10-szeres mennyiségben alkalmazzuk. Az elektro-ozmózis elkerülése miatt a stripeket % glicerinnel is átitatjuk

18 SDS-PAGE A leggyakrabban használt technikák Laemmli ben publikált technikájára épülnek két fontos különbséggel: A ‘stacking’ gélt kiváltja a strip, mivel annyira lágy gél, hogy tökéletesen képes azt pótolni A stripet a szeparáló gél tetejére kell ragasztani felolvasztott agaróz segítségével

19

20 Mintaelőkészítés Izoelektromos fókuszálás SDS PAGE Festés és vizualizáció Gélképek analízise

21 Többféle festési eljárás létezik A három leggyakrabban alkalmazott -Ezüstfestés: nagyon érzékeny, de nem végpontos, ezért nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra -Coomassie festés: kevésbé érzékeny, mennyiségi összehasonlításra alkalmas -Fluoreszcens festések (pl.: SyproRuby): nagyon érzékenyek, kvantitatív festés, de detektálásuk drága berendezést igényel Gél festése

22 Silver Sypro RubyRuBPS BioSafe Coomassie

23 Gél analízis Számítógépes programok segítségével PDQuest, Melanie, Dimension, Phoretix 2D Automatikus spot detektálás és matching A spot kiterjedését és intenzitását veszik figyelembe a mennyiségi analízisnél

24

25 Hasznos linkek bspr.org/Society_links.html proteomicsnetwork.de/ ussion_groups


Letölteni ppt "2D gélelektroforézis a proteomikában. Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME”(Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról."

Hasonló előadás


Google Hirdetések