Szabadgyökök vizsgálati lehetőségei a klinikumban Dr. Kocsis Ibolya Ph.D Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium

OXIDATÍV STRESS JELENLÉTE ÉS SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ BETEGSÉGEKBEN diabetes mellitus és szövődményei cardiovasculáris megbetegedések rheumatoid arthritis daganatos betegségek gyulladásos bélbetegségek a máj, tüdő, vese betegségei kialakulás és prognózis

Oxidációs termékek, mint az oxidatív stress biomarkerei LIPID-FEHÉRJE-DNS- Etán, pentán a kilégzett levegőben Protein karbonilek (stabil, -80 o C-on, 3 hónapig tárolhatók), lysin, arginin, prolin aldehid, keton származékai Thymine glycol TBARSDiszulfid csoportot tartalmazó vegyületek 2,8,-hidroxiadenin Konjugált diénekKeresztkötéseket hordozó fehérjék 8-hidroxiguanin Aldehidek (MDA, acrolein, 4- HNE, 4-ONE) Aldehid módosulatok8-nitro-,kloro-,bromo-, guanin Izoprostánok (F2-izoprosztánok) Dityrosin (vizelettel ürül, oxidatív status megítélésére) 5-OH-uracil oxLDL Oxysterolok (koleszterin- linoleát-hidroperoxid)

900MHz NMR készülék, Birmingham, UK Mintaelőkészítés NMR vizsgálathoz (vékony boroszilikát üveg, 20 Hz)

Szabad gyökök képződésével járó folyamatok vizsgálati lehetőségei Mérőmódszerek: – ESR/EPR, NMR spektroszkópia – Kemilumineszcencia, Fluoreszcencia – UV/látható abszorpciós spektrofotometria – LC-MS/MS, GC-MS/MS

ESR, paramágneses vegyületek közvetlen detektálása

Szabadgyökök ESR spektrumai Az elektronspin rezonancia - ESR (más elterjedt elnevezéssel elektron paramágneses rezonancia - EPR) egy olyan spektroszkópiai módszer, amellyel az elektronok energia-szintjeinek mágneses mezőben való felhasadása vizsgálható.

Az EPR/ESR technikák a ROS vegyületek vizsgálatában Elektron paramágneses rezonancia spektroszkópia

Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLoS ONE 7(10), (2012) ROS (reaktív oxigén gyökök) vizsgálata EPR technikával

Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLoS ONE 7(10), (2012) Szuperoxid gyök (O 2.- ) vizsgálata EPR technikával

Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLoS ONE 7(10), (2012) Peroxinitritek (OONO - ) vizsgálata EPR technikával b a c

Lipidperoxidációs termékek vizsgálati módszerei Nagy hatékonyságú folyadék-kromatográfia Gáz-kromatográfia, kapcsolva tömegspektrometriával (GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS, MALDI-TOF) ELISA TBAR esszé, LC-GC izoláció után

Lipid peroxidáció vizsgálata gyulladásos bélbetegségekben L Kruidenier, I Kuiper et al.: Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants J Pathol 2003;201: 28–36.

Oxidatív stress celluláris és keringő biomarkereinek vizsgálata metabolikus szindrómában (szendvics ELISA) I Jialal,* S Devaraj,* B Adams-Huet, X Chen,et al.: Increased Cellular and Circulating Biomarkers of Oxidative Stress in Nascent Metabolic Syndrome. J Clin Endocrinol Metab97: E1844–E1850, 2012

K.D.Jakob et al.: Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease.Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139–157 DNS származékok vizsgálata különböző betegségekben

Karboxilált fehérjék és a redukált gluthation (GSH) vizsgálata az egyes betegségekben K.D.Jakob et al.: Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease.Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139–157

Izoprosztánok vizsgálata különböző betegségekben K.D.Jakob et al.: Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease.Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139–157

Antioxidáns: Védekezés az oxidatív stressz káros következményeivel szemben E. Niki.:Assessment of Antioxidant Capacity in vitro and in vivo/ Free Radical Biology & Medicine 49 (2010) 503–515

Antioxidáns státusz felmérésére alkalmas vizsgálati tesztek

Leggyakoribb antioxidáns biomarkerek Preventív antioxidáns hatású vegyületek meghatározása : – fémionok megkötésére alkalmas fehérjék : coeruloplasmin, albumin, transferrin, ferritin Kis méretű antioxidáns molekulák : bilirubin, húgysav Antioxidáns enzimszintek (scavengerek) mérése spektrofotometriás, kinetikus módszerekkel (SOD,Kataláz, GPx, Glutathion reduktáz, stb.) Antioxidáns eredetű oxidált vegyületek: tokoferil-kinon(TQ), 5-nitro-γ-tokoferol, allantoin, biopyrrin Oxidált/redukált formák arányainak meghatározása (GSH/GSSG, TQ/TQH 2, UQ/UQH 2 )

Antioxidánsok a vérplazmában

Antioxidáns kapacitás meghatározása fémionok redukciója segítségével FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) – Vas ionok redukciója CUPRAC (Cupric Reducing Antioxdant Power) – Réz ionok redukciója A redukciós folyamat során reaktív ionok keletkeznek, melyek hatására a vizsgált antioxidánsok prooxidánsként viselkedhetnek. HPLC társítva elektrokémiai detektálással

Antioxidáns kapacitás megítélése Biológiai anyagok, folyadékok, növényi kivonatok Globális tesztek: – Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) – Total radical antioxidant parameter (TRAP) – Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) – Total oxyradical scavenging capacity (TOSC) – Össz-scavenger kapacitás (TSC)

Össz-scavenger kapacitás mérőmódszerének alkalmazása Gyulladásos bélbetegségek vizsgálatában a vörösvértestekben és plazmában meghatározott kemilumineszcens fényintenzitás változás mérése (Blázovics és mtsai.1999.Clin Chem 45.) Növényi kivonatok antioxidáns hatásának megítélése (Lugasi A., Szentmihályi K., Kocsis I. 2000, Acta Alimentaria 29, 31) Alkoholos májbetegek redox-homeosztázisának megítélése (Hagymási és mtsai.2000.Eur.J.Gastroenterol. Hepatology 12.)

Kocsis I.: Doktori Értekezések 541, Bp.,2004

Kemiumineszcens aktivitás vizsgálata alkoholos májbetegségben (plazma, vvt-k) (Hagymási és mtsai.2000.Eur.J.Gastroenterol. Hepatology 12.)

Gyökfogó kapacitás meghatározásának spektrofotometriás lehetőségei Reakció „stabil” gyökképző vegyületekkel – Galvinoxyl, – DPPH ( 2,2-difenil-1-pikrilhidrazid) – ABTS (benzthiazolin-szulfonsav) – AAPH (azo-2-amidinopropán)

Torres, P. Galleguillos, E. Lissi, C. López : Antioxidant capacity of human blood plasma and human urine: Simultaneous evaluation of the ORAC index and ascorbic acid concentration employing pyrogallol red as probe. Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, GSH, albumin, húgysav antioxidáns hatásának vizsgálata ORAC metodikával (pyrogallol-vörös és AAPH* gyök kölcsönhatásának követésével) 1: 10 umol/l GSH 2: 100 umol/L Albumin 3: 1 mM / UA kontroll : 25 umol/L Albumin 2: 75 umol/L Albumin 3: 150umol/L Albumin

Aszkorbinsav ORAC értékeinek meghatározása pyrogallol-vörös AAPH* gyök hatására bekövetkező bomlásának időbeni követésével (Spektrofotometria) P.Torres, P. Galleguillos, E. Lissi, C. López : Antioxidant capacity of human blood plasma and human urine: Simultaneous evaluation of the ORAC index and ascorbic acid concentration employing pyrogallol red as probe. Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, plazmavizelet

Aszkorbinsav gyökfogó kapacitásának vizsgálata (ORAC, spektrofotometria) Torres, P. et al: Antioxidant capacity of human blood plasma ………… Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, : 2,5 umol/L 2: 5,0 umol/L 3: 10,0 umol/L 4: 15,0 umol/L 5: 20,0 umol/L

Gyökfogó kapacitás (ORAC) metodika alkalmazása növényi kivonatok vizsgálatában Több, mint 300 növényi exractum besorolása ORAC értékek alapján – TE/100 mg: trolox equivalens /100g – US Department of Agriculture website ( RAC/ORAC07.pdf)

Elfogadott mérőmódszerek: HPLC Kapilláris ELFO

Vitaminok (C,E) GSH és GSH észterek transz β-karotin N-acetyl-cystein Glutamin (glutamát forrás) Szelén Genistein és Daidzein (szójamag) Quercetin vese- és kardioprotektív hatás bélmucosa védelme

SDAAF : zsírtalanított alkoholos szójaliszt kivonat Lexirin : vizes szójaliszt kivonat

nyers szójaliszt alkoholos kivonat vizes kivonat

Az oxidatív stressz vizeletben vizsgálható biomarkerei, „validitási” problémák F2-isoprostanes:  megfelelően informatív ox.stress biomarker, ismert intra-, inter individuális variabilitással MDA:  Nem elég szenzitív, sem szérum, sem vizeletmintában, humán vizsgálatok alapján 8-oxo-Guanidin:  Intra-, inter- individuális variabilitása nem megfelelően tisztázott humán vizsgálatokban  Állatkísérletek eredményei alapján megbízható biomarker allantoin:  Előnyös stabilitási jellemzők különböző tárolási körülmények között  A variabilitási jellemzők pontos meghatározása további vizsgálatokat igényel D. Il'yasova et al.: Urinary biomarkers of oxidative status. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 1446–1453

8-oxo-Guanidin biológiai variabilitásának vizsgálata (isocratic LC–MS/MS system (positive-ion MRM mode) a., Adott napon belüli variabilitás (4 mintavétel/24 óra) K. Lee et al. / Clinica Chimica Acta 411 (2010) 416–422 b., Napok közötti variabilitás (5 egymást követő napon, azonos időben történő mintavétel)

D. Diakowska et al. : Evaluation of 8-hydroxydeoxyguanosine, thiobarbituric acid-reactive substances…/ Clinical Biochemistry 41 (2008) 796–803 Hatásfokmérő karakterisztika (ROC görbe – Receiver operating characteristics curve) TBARS 8-OH-deoxoguanidin TAS

TBARS, 8-OHdG és TAS biomarkerek, mint lehetséges diagnosztikus paraméterek jellemzői D. Diakowska et al. : Evaluation of 8-hydroxydeoxyguanosine, thiobarbituric acid-reactive substances…/ Clinical Biochemistry 41 (2008) 796–803

Related profiles: Coenzyme Q10 NutrEval® FMV ONE (Optimal Nutritional Evaluation) FMV™ Oxidative Stress Analysis 2.0 (Blood) nutritional-test-blood-urine Oxidatív stressz mértékének vizsgálata A szabadgyökök hatására bekövetkezett oxidatív károsodás mértéke – Lipiperoxidációs termékek – DNS-károsodás következtében felszaporodó vegyületek (vizeletben): 8-hydroxy-deoxy-Guanosine Antioxidáns védelem, kapacitás vizsgálata – Teljes vér Glutathion tartalma – Szabadgyökök eliminálását végző enzimek : szuperoxid dizmutáz, glutathion peroxidáz

Külföldi példa: „Oxidative Stress Analysis 2.0 (Blood)” CPT CODES: Cysteine82136 Glutathione82978 Glutathione, Peroxidase84311 Lipid Peroxides84311 Sulfate84311 Superoxide dismutase (SOD)84311 Total Antioxidant Capacity, TAC nutritional-test-blood-urine report-review/ox-stresswww.gdx.net/learngdx/ report-review/ox-stress

Köszönöm a figyelmet !