A P elemek felfedezése, felépítése és mobilitásuk mechanizmusa Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elemek felfedezése, felépítése és mobilitásuk mechanizmusa

P elem függő hibrid diszgenezis Nőstény szülő Hím szülő M P normális diszgenikus Csak M és P törzsek közötti keresztezés okoz hibrid diszgenezist, de csak akkor, ha a hím származik a P törzsből

P elemek populációs biológiai megoszlása a Drosophilidaek között Nem mindegyik faj hordoz P elemeket A D. melanogaster faj legközelebbi rokonaiban nem mutatható ki P elem Távolabbi rokon fajok, D.willistoni és D.saltans hordoznak P elemeket A D.willistoniban talált P elem csak egyetlen bp-ban különbözik a melanogasterben lévőtől. Ez azt valószínűsíti, hogy a P elemek horizontális transzferrel kerültek át a D.willistoniból a D. melanogasterbe. A horizontális transzfer mechanizmusa ismeretlen. Legalább 60 milliós evolúciós jelenlét ellenére miért csak mostanában terjedtek el a P elemek a D. Melanogasterben? D. villistoni Közép- és Dél-Amerikából származik, és még ma is ott endemikus. D. melanogaster ma egy kozmopolita faj, de Nyugat-Afrikából származik Feltételezik, hogy Amerikába az 1800-as évek elején jutott el. A horizontális transzfer bármikor bekövetkezhetett azután, hogy a két elterjedési területe átfedett, azonban 1930-as évekig a P elemek még nem árasztották teljesen el a D. melanogaster populációkat A P elemek invázió-szerű elterjedése valószínűleg hatékony transzpozíciós mechanizmusuknak köszönhető.

A vad típusú P elem felépítése 31 bp IR 31 bp IR CATGATGAAATAACATAAGGTGGTCCCGTCG CGACGGGACCACCTTATGTTATTTCATCATG 1 31 2877 2907 ATTAACCCTTA 11 bp IR TAAGGGTTAAT 11 bp IR 126 136 2763 2773 IR ORF 0 ORF 1 ORF 2 ORF 3 IR 1 85 442 501 1168 1222 1947 2138 2706 2907 Intron 1 Intron 2 Intron 3

A P elem által kódolt mRNS-ek és fehérjék ATG TGA TAA ORF 0 ORF 1 ORF 2 ORF 3 IR AUG UAA AAAA ivarsejt mRNS 87 kD transzpozáz AUG UGA AAAA szomatikus mRNS 66 kD represszor AUG UAA belső deléció AAAA deléciós mRNS 24 kD represszor

A P elem transzpozáz fehérje felépítése DNS-kötő domén Foszforilációs helyek Dimerizációs GTP-kötő régió Katalitikus régió

A P elem transzpozáz Helyspecifikus DNS-kötő endonukleáz, ami a polinukleotid-transzferázok családjába tartozik. Mg2+ és GTP kofaktorok szükségesek az aktivitásához. Specifikus kötőhelye a P elemen végein található 31bp-os és 11 bp-os fordított ismétlődő szekvenciák között található (KD 10-9 M). Rendkívül magas a nem specifikus DNS-kötő képessége is (KD 10-8 M). Kötőhelye eltérő távolságra van a két végen található hasító helyektől. Kötőhelye a P elem 5’-végén átfed a transzpozáz gén promóterében található TATA box-al, ezért az enzim transzkripciós represszorként is működhet. Csak az 5’- és a 3’-végek egyidejű jelenlétében képes hatékony DNS hasításra. Hasításának eredményeként 17 bp-os, 3’-túlnyúló ragadós végek képződnek. A 3’ hasítóhely pontosan a P elem végén, míg az 5’ hasítóhely a végtől 17 bp-ra van.

Transzpozáz kötőhelyek a P elemben konszenzus transzpozáz kötőhely 87 IRBP mRNS 31bp IR Transzpozáz P elem promoter 11bp IR 1 31 48 68 126 136 IRBP 11bp IR Transzpozáz 31bp IR 2763 2855 2871 2877 2907 GAAGTATACACTTAAATTCAG CTTCATATGTGAATTTAAGTC 21 bp-ra az 5’ IR végtől 48 68 ATA/CCACTTAA TAT/GGTGAATT konszenzus transzpozáz kötőhely ACGTTAAGTGGATGTCTC TGCAATTCACCTACAGAG 9 bp-ra a 3’ IR végtől 2855 2871

A P elem transzpozoszóma felépítése 8 bp-os inszerciós hely duplikáció 3’-vég 5’-vég A DNS hasítás első lépésében a P elem végek szinapszist alkotnak. Stabil nukleoprotein komplex jön létre. A DNS hasítási és javítási reakciók ebben a komplexben játszódnak le. A komplexet transzpozoszómának nevezzük. 31 bp-os IR szekvencia IRBP 9 21 bp-os spacer szekvencia 10 bp-os Transzpozáz kötőhely transzpozáz P elem

A P elem kivágódás mechanizmusa Inszerciós hely duplikációja NNNNNNNN CATGATGAAATAACATAAGGTGG GTACTACTTTATTGTATTCCACC P elem CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGAATACAATAAAGTAGTAC NNNNNNNN Inszerciós hely duplikációja 3’ vég 5’ vég NNNNNNNN CATGATGAAATAACATA GTACTACTTTATTGTATTCCACC AGGTGG CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGA P elem ATACAATAAAGTAGTAC NNNNNNNN

A kettősszálú DNS törés javításának modelljei A DSBR modell szerint szekvencia információ mindkét irányban folyik a templát és a célkromoszómák között. P elem mobilizáció során a konverzió csak egyirányú: mindig a templátról a célkromoszómára történik. A Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) modell jobban leírja a Drosophilában lejátszódó eseményeket: - egyszálú DNS javítást feltételez - DNS szintézis un. buborék vándorlás szerűen játszódik le - nem alakul ki Holliday struktúra

A P elem kivágódást követő DNS javítási útvonalak Leánykromatida-függő javítás P elem Homológ kromoszóma-függő javítás P elem Nem homológ végek összetapadása

A P elem inszerció mechanizmusa NNNNNNNN GTACTACTTTATTGTATTCCACC AGGTGG CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGA P elem NNNNNNNN GTACTACTTTATTGTATTCCACC AGGTGG CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGA P elem NNNNNNNN CATGATGAAATAACATAAGGTGG GTACTACTTTATTGTATTCCACC CCACCTTATGTTATTTCATCATG GGTGGAATACAATAAAGTAGTAC Inszerciós hely duplikációja P elem

A P elem inszerciós preferenciái Az inszerciós hely szelekciójának pontos mechanizmusa nem ismert, azonban néhány szabályszerűség megfigyelhető: Inszerciók nem random történnek, bizonyos szekvenciák preferáltak. Inszerciók gyakrabban fordulnak elő eukromatinban, mint heterokromatinban. Az eukromatinban un. inszerciós forró pontok találhatók. Gyakran fordul elő inszerció másik P elemben, vagy annak közvetlen közelében. Inszerciós gyakoriság nagyobb lokálisan, mint távolabbi régiókban. Inszerciós gyakoriság nagyobb a nőstény csíravonalban, mint a hímivarsejtekben. Génen belül inszerciósan preferáltak a nem kódoló 5’-végi szekvenciák. Az inszerciós hely GC-ben gazdag