Gyógyszerként használt fehérjék előállítása

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
Utazás a sejtben Egy átlagos emberi sejt magja megközelítőleg 510-15 gramm mennyiségű és 1,8-2 méter hosszúságú (3000 millió bázispárnyi) DNS-ből,
Advertisements

Mol. biol. módszerek 1. Dr. Sasvári Mária
Mi az a mikroorganizmus?
Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária
FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ
DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció
Elektroforézis Általában agaróz a hordozó
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
DNS replikáció: tökéletes másolat osztódáskor
A humán genom projekt.
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.
Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
Bakteriális genom térképezés Készítette: Mlinarics Edina IV. Biológus Bioinformatika SZIT.
Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
Molekuláris genetika Falus András.
Kedvenc Természettudósom:
Nukleotidok, nukleinsavak
Polimeráz láncreakció (PCR)
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
A nukleinsavak.
GAZDA GRAS: generally recognized as safe Intracelluláris / szekréció Proteázok Termelés, szekréció szinkronizálás Gazda kialakítása.
A λ bakteriofág +++. Kb db fág van a bioszférában Bakteriofágok vegetatív replikációs ciklusa.
Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén.
Poszttranszlációs módosítások Készítette: Cseh Márton
Transzdukció Készítette: Őri Zsuzsanna Emese 2007.március 30.
Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)
Készítette: Leidecker Orsolya
Gélelektroforézis Molina Csaba.
Transzgénikus állatok
DNS chipek, DNS hibridizáció
FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése
A gélelektroforézis Alkalmazása: különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék) -méret szerinti elválasztását, -detektálását -mennyiségének meghatározását.
NUKLEINSAVAK MBI®.
A KÖZPONTI TOLERANCIA A CSONTVELŐBEN ÉS A TÍMUSZBAN ALAKUL KI
AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE. AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz.
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
Génsebészet Cseh Zsófia.
Dr. Bugyi István Kórház Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály,
Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás
1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.
A P elemek mobilitásának szabályozása
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
A SEJTCIKLUS ÉS A RÁK KAPCSOLATA
Immunbiológia - II. A T sejt receptor (TCR) heterodimer CITOSZÓL EXTRACELLULÁRIS TÉR SEJTMEMBRÁN kötőhely  lánc  lánc VV VV CC CC VV VV
PLAZMA SEJT ANTIGÉN CITOKINEK B-SEJT A B – SEJT DIFFERENCIÁCIÓT A T-SEJTEK SEGÍTIK IZOTÍPUS VÁLTÁS ÉS AFFINITÁS ÉRÉS CSAK T-SEJT SEGÍTSÉGGEL MEGY VÉGBE.
Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása)
Escherichia coli baktérium
Molekuláris klónozás a gyakorlatban. CRISPR/Cas rendszerek Adaptív bakteriális immunitás Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) Ezek integrálása a genomba,
4. lecke Nem sejtes rendszerek Vírusok, viroidok és a prionok.
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
Vakcinák. Edward Jenner Fekete himlő Tehén himlő Fekete himlő Tehén himlő
43. lecke A Humán Genom Program
Új molekuláris biológiai módszerek
Polimeráz Láncreakció:PCR, DNS ujjlenyomat
Molekuláris biológiai módszerek
RNS TUMORVÍRUSOK (Retrovírusok)
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
Új molekuláris biológiai módszerek labor
The lactose (lac) operon - an example for prokaryotic gene regulation
Proteomika, avagy a fehérjék „játéka”
Molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
A DNS replikációja Makó Katalin.
Új molekuláris biológiai módszerek
Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények
Biotechnológia.
Előadás másolata:

Gyógyszerként használt fehérjék előállítása Rekombinans DNS technológia

Fehérjék felhasználásának célja: hiányzó vagy funkcióképtelen fehérje helyettesítése betegség diagnózisa vakcinálás: védekezőképesség fokozása Fehérjék előállításának módjai: tisztítás állati szervből tisztítás ember szervéből, vérből in vitro fehérjeszintézis rekombinans DNS technológia baktériumok vagy eukariota sejtkultúra felhasználásával Fehérjetisztítás lépései: sejtfeltárás, összetörés ultracentrifugálással sejtorganellumok elválasztása gélszűrés: méret szerinti elválasztás ioncserélő kromatográfia: töltés szerinti elválasztás affinitáskromatográfia: specifikus kölcsönhatás alapján elválasztás

A tisztított fehérje tisztaságának vizsgálata poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) Veszélyek: szennyezés a beteg számára idegen, a fehérjeforrásból (másik egyedből, fajból) származó fehérjékkel, melyek antigénként immunválaszt produkálnak szennyezés vírussal (pl. Hepatitis B vírus a vérkészítményekben) szennyezés prionnal (hypophysisből származó növekedési hormon) DNS felhasználása: helyettesítésre: génterápia egyedek azonosítása pl. Alu szekvenciával (bírósági perekben is) detektálás: vírusok, baktériumok, daganatos sejtek jelenléte örökletes megbetegedések prenatalis vagy postnatalis diagnózisa az evolúció kutatása, kihalt lények vizsgálata RNS használata antiszenz RNS a rossz, vagy feleslegben levő gén ellen

Gyógyászatban használt tisztított fehérjék albumin heparin antitrombin pancreas emésztő enzimek urokináz sztreptokináz tripszin egyes hormonok Szintetizált peptidek oxytocin 9 octreotid 8 (szomatosztatin analóg) tetracosactid 24(ACTH 39 analóg) calcitonin 32 (lazac) vazopressin 8 és analógjai

A rekombinans géntechnológiában használt kifejezések magyarázata rekombináns DNS: eredetileg ott nem levő DNS darabot tartalmazó DNS (másik kromoszómából, másik egyedből, másik fajból = kiméra) DNS denaturálása = megolvadása = egyszálúvá tétele: hővel (90 C), lúggal hibridizáció = renaturálás = reasszociáció = kétszálúvá tétel: komplementer bázisok hidrogén-hidat képeznek DNS hasítása: restrikciós endonukleázzal bizonyos szekvenciákra specifikus helyen nukleinsav fragmensek szétválasztása nagyság szerint: gélelektroforézissel (agar, PAGE), a sok foszfát negatív töltésűvé teszi a nukleinsavakat nukleinsavak láthatóvá tétele gélen: beépített 32P-izotóp → béta-bomlás → fotoemulzión autoradiográfia beékelődő etidium-bromid → UV-fény → fluoreszkálás DNS-fragmens sokszorozása PCR = polymerase chain reaction klónozás vektor segítségével baktériumban, gombában, sejttenyészetben

DNS-fragmensek szekvenálása = bázissorrrend meghatározása: 1.) különböző bázisok mellett specifikusan, kémiai ágenssel történő hasítással = Maxam-Glilbert kémiai módszere 2.) komplementer lánc megszakított enzimatikus szintézisével = Sanger didezoxiribonukleotidos módszere II. típusú restrikciós endonukleáz: baktériumok által termelt, a genomjukba beépülő idegen, virális DNS-t kimetszeni tudó, ezért a vírusok szaporodását gátló, a DNS-t specifikus helyen, valahol a láncon belül hidrolizáló enzim. 4-8 bázispár hosszú nem metilált palindrom szekvenciát ismernek fel, ezen belül hasítanak, vagy mindkét szálon azonos helyen hasítva tompa véget, vagy a két szálon különböző helyen hasítva ragadós véget létrehozva. Az azonos szekvenciát felismerő metiláz a saját DNS-t közvetlenül osztódás után metilálja. vektor: rekombináns DNS-t tartalmazó, a gazdasejtben szaporodni tudó hordozó

plazmid: kis, cirkuláris, extrakromoszomális, baktériumban önállóan szaporodó, antibiotikum-rezisztenciát vagy sex-faktort hordozó DNS bakteriofág: baktériumban szaporodó vírus klón: egy őstől származó, egy sejtből eredő, ezért azonos genetikai információt hordozó populáció próba: radioaktívan erősen jelzett, mesterségesen előállított, ismert bázissorrendű 10-20-nukleotidnyi egyszálú DNS vagy RNS, mely hibridizálni fog a keresett nukleotidfragmens egy részletével blottolás: gélről nitrocellulózra, nylonra, stb. elektromos térben átvitt néhány molekula, mely az új hordozón kimutatható, azonosítható, a blottolás megismételhető, a kimutatott molekula eredeti pozíciója a gélen vissza- kereshető DNS-könyvtárak: a.) genomiális: az egyed (pl. humán) teljes kromoszómaállományát feldarabolva, külön klónokban tartalmazó baktériumok tenyészete b.) complementer: egy sejt messenger RNS-állományáról kettősszálú DNS-sé visszaírt DNS-fragmenseket tartalmazó baktériumtenyészete

PCR animation

PCR: minden ciklusban duplikálódik a DNS-fragmentum

Construction of complementer DNA library az egyedre, egy szövetére, adott fejlettségére jellemző mRNS-ek összessége, mely a sejtre jellemző arányban tartalmazza az ott expresszálódó fehérjék mRNS-eit, intronok, reguláló szekvenciák stb. nélkül

Construction of genomic DNA library using bacteriophage A genomiális DNS-könyvtár az élőlény összes kromoszómájának minden részét tartalmazza átfedő szekvenciákkal, mert a hasítás nem minden lehetséges helyen történt meg 50000 kolónia/petricsésze tenyésztés táptalajon 20-30 petricsésze/humán genom

Clone selection by probe and autoradiography

Kisebb genomú élőlények vagy cDNS-könyvtár létrehozása plazmiddal

DNA sequencing by Sanger-method: interrupted synthesis of complementer strand

DNA sequencing by Sanger-method: interrupted synthesis of complementer strand

DNA sequencing by Maxam – Gilbert method: specific cleavage by chemicals

DNA sequencing by Maxam-Gilbert method: detection by gel electrophoresis

Protein (G-CSF) synthesis by bacterial expression vector

Synthesis of insulin by bacterial expression vector

A fehérjék előállítására használt, plazmidot tartalmazó bakteriális expressziós vektornak tartalmaznia kell: ori régió: a DNS-replikáció kezdőpontja polilinker régió: több hasítási hely a beilleszteni kívánt idegen DNS-darab számára, megfelelő restrikciós endonukleázok felismerő helyeivel szelekciós marker: a plazmid jelenlétét bizonyító antibiotikumrezisztencia-gén szabályozó régió: a beilleszteni kívánt gén előtt, a promoter régió a gazdasejt, vagyis a baktérium számára megfelelően szabályozza a génátírást pl. az Escherichia coli számára a béta-galaktozidáz promotere

Recombinant DNA technology products Proteins and their indication of usage: Insulins – diabetes mellitus STH = GH = somatotroph hormon = growth h. - dwarfism erythropoetin – anaemia because of renal failure interferon – leukemia molgramostin = granulocyte-macrophage stimulatory factor – immun deficiency tPA = tissue type plasminogen activator – thrombolysis Hepatitis B virus antigen – active immunization Blood clotting factor VIII - hemophilia Genes: CFTR = cystic fibrosis transmembrane regulatory protein = chloride channel in epithelial cells ADA = adenosine deaminase