BARABÁS József2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1 Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya1, FÖLDES Anna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZ Ádám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 , BARABÁS József2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1 1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK Háttér Sjögren szindróma sugárterápia (fej-nyaki tumorok kezelésére) csökkent nyáltermelés hiposzaliváció acinus sejtek pusztulása Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra) Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172 PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra) Szlavik et al. Tissue Eng 2008 14:1915-26 Célkitűzés 400 000 new patient per year humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlítása optimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásához transzepitheliális ionáramok vizsgálata az elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása

Sejttenyésztés – primer kultúra Módszerek és eredmények Sejttenyésztés – primer kultúra gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok” egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok” Transzpithelialis rezisztencia mérése PTHSG Hepato-STIM huSMG Hepato-STIM 10x 10x 400 800 1200 2 4 6 8 days TEER (Ωcm2) MEM 0 nap Hepato-STIM MEM 2 nap MEM 1. nap PTHSG MEM huSMG MEM Kulcstranszporterek (RT-CR) 10x 10x NBC1 NKCC1 NHE1 ENaC Pozitív kontroll: K: Vese Minta jelölések: Me: membránról izolált Pl: plasztikról izolált Ti: nyálmirigy szövetből izolált Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (Isc) mérésével Hepato-STIM medium (BD Biosciences) MEM medium (Sigma) 10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma) Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco) Transwell Clear (Corning Costar) Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (World Precision Instruments) Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.) Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma) Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL) RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem) HEPES-puffer oldat, 100% O2; HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és Cl—mentes oldat amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma)

Eredmények Klorid és bikarbonát megvonásának hatása BAZOLATERALIS OLDAL bumetanid Na+ Na+ Cl- Na+ Na+ K+ Cl- HCO3- NKA K+ Na+ ATP ADP+P NKA K+ Na+ ATP ADP+P CO2 K+ NKCC1 - NHE AE NBC H+ HCO3- DUCT CA II + Na CO2+H2O H2CO3 H++HCO3- Ca2+ + cAMP + PKA II ACINI Cl- Cl- HCO3- ENaC ? CFTR CaCC ATP karbakol - forskolin Na+ Cl- Cl- HCO3- + Na 10 µM amilorid APIKALIS OLDAL Klorid és bikarbonát megvonásának hatása Vektoriális iontranszport aktiválása nem stimulált ATP stimulált szekrécióra PTHSG huSMG PTHSG PTHSG huSMG 8 * * 8 8 6 6 6 * * * ∆Isc (µA/cm2) 4 * * Isc (µA/cm2) 4 ∆Isc (µA/cm2) 4 2 2 2 8 8 11 5 4 4 4 8 5 8 6 *p<0,05 vs baseline *p<0,05 *p<0,05 HCO3- + - HCO3- + - + - ATP carbachol forskolin Cl- + Cl- + - - Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra Apikálisan adott amilorid hatása nem stimulált ATP stimulált szekrécióra 8 PTHSG 8 PTHSG 8 PTHSG huSMG 6 6 6 * * ∆Isc (µA/cm2) 4 * Isc (µA/cm2) 4 * * ∆ Isc (µA/cm2) 4 2 2 2 5 5 9 9 9 9 3 8 8 8 3 HCO3- + + - - *p<0,05 HCO3-& Cl- + + - *p<0,05 HCO3-& Cl- + + + + *p<0,05 Bum - + - + Ami - + + Ami - + - +

Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor Megbeszélés Primer sejtkultúra: polarizált epithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző) Cl- és HCO3- Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző) Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva: működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas Apikális oldal Transwell Cl-;HCO3ˉ Na+ Bazolaterális oldal Támogatás: TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;