Daphnia magna reprodukciós teszt OECD Test No Daphnia magna reprodukciós teszt OECD Test No. 211: Daphnia magna reproduction test szív Készítette: Privóczki Csaba tojás antennák lábak

Tartalomjegyzék Ökotoxikológiai tesztek A tesztorganizmus A teszt célja A vizsgálat Körülmények Mérés Paraméterek Oldószerek Etetés Végpont Észrevételek Jegyzőkönyv Források

Ökotoxikológiai tesztek Teszt időtartama lehet: Akut – rövid időtartam (24, 48 illetve 72 óra) Krónikus – hosszabb időtartam (függ a tesztorganizmus életidejétől illetve reprodukciós ciklusának hosszától) Tesztrendszer fajösszetétele: Egy fajt alkalmazó teszt alkalmazhat Szárazföldi tesztorganizmust Vízi tesztorganizmust Üledéklakó tesztorganizmust Több fajt alkalmazó teszt Több fajt alkalmaz együtt

A tesztorganizmus A kis vízibolha a vízibolhák legismertebb képviselője. A nőstény 3–4 milliméter, a hím 1,5 milliméter hosszú. Az állat törzsét két félből álló áttetsző héj burkolja, melyből csak a feje nyúlik ki, és lefelé egy tüskében folytatódik. A kis vízibolha kisebb állóvizek és tavak lakója. A mikroalgát nagy mennyiségben fogyasztják, a Daphniák száma gyakran erősen függ a lebegő algák sűrűségétől. Taxonómiai besorolás: Ország: Animalia, állatok Törzs: Athropoda Altörzs: Crustacea, rákok Osztály: Branchiopoda Rend: Diplostraca Család: Daphniidae Nemzetség: Daphnia Faj: Daphnia magna

A teszt célja Annak a felmérése, hogy mi a hatása a vegyi anyagoknak a Daphnia magna szaporodási teljesítményére egy krónikus teszt során, adott anyag hatására mennyi utód marad a teszt végére A reprodukciós teljesítményt a kontroll mintához viszonyítjuk annak érdekében, hogy meghatározzuk a legalacsonyabb megfigyelhető hatást okozó koncentrációt (LOEC), és így a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt is (NOEC). Majd ebből számoljuk az EC20 és EC50 értékeket. Az eredmények az akut toxicitási vizsgálatból (lásd OECD 202: Daphnia akut immobilizációs teszt) felhasználhatóak, hogy megfelelő koncentráció tartományt tudjunk kiválasztani a reprodukciós teszthez.

A vizsgálat A teszt során szükséges, hogy: A vizsgálat kezdetén olyan fiatal Daphnia nőstényeket használunk, amelyek 24 óránál fiatalabbak Egészséges állományból kell származniuk A vizsgálat végén az összes élő utódot összeszámoljuk (külön az egyes szülőkre számolva). A fiatalok akiket a felnőtt egyedek hoztak létre és meghalnak a vizsgálat során ki kell zárni a számításból. A teszt végén a reprodukciós teljesítményt több módon is ki lehet fejezni (pl.: hány db élő utód jött létre naponta egy daphniára vetítve, ahol az első naptól kezdve megfigyelték az új egyedeket), de ezeket is jelenteni kell az utódok teljes száma mellett (élő szülőkre vonatkoztatva). Le kell jegyezni a szülők túlélését és az első utód megjelenéséig eltelt időt

A vizsgálat A vizsgálat akkor érvényes, ha a következő teljesítmény-kritériumok teljesülnek a kontroll mintában: A szülők mortalitása (nőstény Daphnia) nem haladja meg a 20%-ot a vizsgálat végén Az élő utódok átlagos száma szülőkre viszonyítva a teszt végén több mint 60 Berendezések: Oxigén mérő (mikroelektróddal vagy más olyan berendezéssel ami az oldott oxigén mérésére alkalmas csekély mennyiségű oldott oxigén mérésére a mintában Megfelelő készülék a hőmérséklet szabályozásához pH-mérő Vízkeménység mérő Meghatározó készülékek az összes szerves szén koncentrációjának (TOC), a víz vagy meghatározó készülékek a kémiai oxigénigény (COD) Fényerősség mérő

A vizsgálat Teszt időtartama 21 nap A szülőket egyenként érdemes tartani, 50-100 ml tesztoldattal (statikus teszt, 10-10 Daphnia egy csoportban Dinamikus mérésnél néha nagyobb mennyiséggel kell dolgozni (adott analitikai méréshez mérten) Ekkor ha több mint 100 ml mintával dolgozunk, több tesztorganizmusra van szükség (40 Daphnia szétosztva 4 db 10-es csoportra, vagy 20 szétosztva 4x5 Daphnia-ra Ha csoportban van tartva akkor nem lehet kifejezni az egy Daphnia által szült utódokat a teszt végén Ebben az esetben az összes utód számát kell kifejezni az összes megmaradt szülőre a teszt végén

Körülmények Fény: 16 órás megvilágítási időszak legfeljebb 15-20 μE/m2•s fényintenzitással. Hőmérséklet: A vizsgálati közeget 18-22 °C-os tartományon belül javasolt tartani (ha lehetséges több mint 2° C-ot ne változzon a mérés közben pl. 18-20, 19-21, illetve 20-22 °C) Levegőztetés: A vizsgálati edényeket nem szabad levegőztetni. Tesztfolyadék frissítése: A vizsgált anyag stabilitásától függ, de legalább hetente háromszor el kell végezni. Ha a vizsgált anyag koncentrációja nem stabil (azaz kívül esik a 80-120%- os intervallumon vagy a kiinduláskor mért koncentráció 80%- a alá csökken), akkor meg kell fontolni gyakoribb közeg megújítást.

Körülmények Ha új Daphnia szülőket használunk, akkor 3 hetes akklimatizálódási periódus szükséges Előre meghatározott tápoldattal javasolt dolgozni, hogy ne legyen benne semmi adalékanyag (amiket nehéz mérni) Ezáltal jobb összemérhetőség lesz a laborok között Elendt M4 és M7 oldatok használata (2. számú függelékben az OECD teszt végén) Ettől lehet eltérni, de ezt jegyzőkönyvben jelölni kell

Mérés Mérés elején TOC (Total Oranic Carbon – teljes szerves széntartalom) és COD (Chemical Oxigen Demand – kémiai oxigén igény) mérés Javasolt, hogy TOC≤2 mg Ha a vizsgálandó anyag tartalmaz fémeket, akkor ezt figyelembe kell venni (befolyásolhatja a toxicitást – vízkeménység változása, kelátképződés)

Paraméterek Az oldott O2 tartalom≥3 mg/l a teszt elején és közben is pH: 6-9 (párhuzamos méréseknél 1,5 egységnyi eltérés lehet) Keménység CaCo3-ra vonatkoztatva 140 mg/l Ezek a kritériumok fontosak hogy demonstrálható és reprodukálható legyen a teljesítmény a validálási kritériumokkal szemben

Oldószerek Szerves oldószerekre vagy diszpergálószerekre szükség lehet egyes esetekben, hogy a megfelelő koncentrációjú törzsoldatot készítsünk előt, de törekedni kell, hogy minél kevesebbet használjunk fel ezekből. Alkalmas oldószer lehet az aceton, etanol, metanol, dimetil- formamid és a trietilénglikol. Alkalmas diszpergálószer a Cremophor RH40, metilcellulóz (0,01%) és a HCO-40. Minden esetben a vizsgált anyag vízoldhatósága nem haladhatja meg a törzsoldat vízoldhatóságát. A diszpergálószerek segíthetnek a pontos adagolásban és diszperzióban. Az oldószerek a törzsoldat előállításában segítenek, amit így a vízbe pontosan lehet adagolni. A javasolt oldószer- koncentrációnál (azaz ≤ 0,1 ml / l) a fentebb felsorolt oldószerek nem gyakorolnak toxikus hatást és nem fokozzák a vizsgált anyag vízoldhatóságát.

Etetés Táplálás A statikus vizsgálatoknál az etetést lehetőleg naponta kell elvégezni, de legalább hetente háromszor. Az ettől való eltéréseket a jegyzőkönyvben jelezni kell. A vizsgálat során az etetésnél az alábbi mikroorganizmusokat javasolt használni: élő algasejtek Chlorella spirulina Selenastrum capricornutum Pseudokirchneriella subcapitata Scenedesmus subspicatus Az etetés célja a megfelelő mennyiségű szerves szén bevitele (az elegendő számú utód eléréséhez szükséges napi szint 0,1-0,2 mg C / Daphnia / nap

Végpont Ha a teszt célja LOEC / NOEC meghatározása, akkor a legalacsonyabb vizsgálati koncentrációnak elég alacsonynak kell lennie ahhoz, hogy a termékenység az adott koncentráción nem lényegesen alacsonyabb, mint a kontroll mintában. Ha ez nem így van, a vizsgálatot meg kell ismételni egy csökkentett koncentráción. Ha az EC50 szaporodásra gyakorolt hatását vizsgáljuk, akkor célszerű, hogy a legnagyobb vizsgált koncentráció nagyobb, mint ez az EC50 érték.

Észrevételek A mindkét szülő által termelt utódokat lehetőleg el kell távolítani és megszámolni naponta az első szaporulat megjelenésétől, emellett a halott szülőket is meg kell számolni. Habár a mérés célja csak az élő utódok számolása, de a teszt során a megmaradt tojásokat és az elhalt utódok számát is fel kell jegyezni. Az oxigén koncentrációt, hőmérsékletet, keménységet és a pH-t meg kell mérni legalább hetente egyszer, egyrészt a friss és régi tesztoldatban és másrészt a kontroll mintában. Az összes utód számát egy szülő állatra vonatkozóan ki kell számítani az egyes méréseknél. Ha bármelyik párhuzamos mérésnél a szülő állat elpusztul a vizsgálat során vagy kiderül, hogy hím egyed, akkor ki kell zárni az elemzésből és értékelésből.

Jegyzőkönyv tartalma A vizsgált anyag: Fizikai jellege és fontos fizikai-kémiai tulajdonságai Kémiai azonosítást segítő adatok, beleértve a tisztaságot Teszt fajok: Ha a Daphnia magna-tól eltérő fajokvannak használva, akkor jelezni kell Vizsgálati körülmények: Használt vizsgálati eljárás (pl. fél-statikus vagy átfolyásos, terhelés számában Daphnia / liter) Megvilágítási időszakok és a fény intenzitása A vizsgálat kialakítása (pl.: párhuzamos mérések száma, a szülők száma a párhuzamos mérésekben) Táptalaj tulajdonságai Részletes információk az etetésről beleértve a mennyiséget (mg C / Daphnia / nap) és a menetrendet (például az algák pontos nevét (faj) és amennyiben ismert a törzs és tenyésztési körülmények) A törzsoldat elkészítésének módja és a vízcsere gyakorisága (az oldószer vagy diszpergálószer koncentrációját meg kell adni)

Jegyzőkönyv tartalma Eredmények: Előzetes vizsgálatok a vizsgált anyag stabilitásáról A névleges vizsgálati koncentrációk és a vizsgálatok eredmények A vizsgált anyag koncentrációja a vizsgálati edények (lásd a példát az adatlap 5. mellékletében), a módszer eredményessége Vízminőség a kísérleti edényben (pl.: pH, hőmérséklet és oldott oxigén koncentráció, TOC és / vagy COD és keménység adott esetben - lásd a példát az adatlap 4. mellékletében) A teljes rekord az élő utódok minden egyes szülő állatok (lásd a példát adatlap 4. melléklet) A halálozások száma, a szülőket száma és az adott időpont (nap), amelyen történt (lásd például az adatlap 4. mellékletét)

Források OECD teszt 211: Wikipédia: Laborgyakorlat leirat (BME ABÉT): http://oberon.sourceoecd.org/vl=11886421/cl=21/nw=1/rpsv/ij/oecdjournals/1607310 x/v1n2/s12/p1 Wikipédia: http://hu.wikipedia.org/wiki/Kis_v%C3%ADzibolha Laborgyakorlat leirat (BME ABÉT): http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/vizi%20tesztorganizmusok.pdf Képek: http://www.sciencebuddies.org/science-fair-projects/project_ideas/Zoo_p048.shtml http://www.mblaquaculture.com/content/organisms/daphnids.php http://www.pondscape.be/picpondlife.html http://www.ulrichhopp.de/serie_kleinkrebse/Kleinkrebse_013.htm http://greenwichroundup.blogspot.com/2008_09_17_archive.html Letöltve: 2010.11.22.