Hal akut toxicitási teszt (OECD 203) Készítette: Pomucz Anna Boglárka Gruiz Katalin Környezettoxikológia előadásához

Teszt jellemzése A teszt során halakat használunk a vízhez adott, vizsgálni kívánt minta toxicitásának teszteléséhez. A mérés végpontja, a halak pusztulása illetve túlélése. A vizsgálat időtartama 96 óra.

A teszthez ajánlott fajok Ajánlott tesztelési hőmérséklet (°C) A teszteléshez használt halak ajánlott teljes testhossza (cm) Név Latin név zebradánió Brachydanio rerio 21–25 2,0 + 1,0 ponty féle Pimephales promelas Cyprinus carpio 20–24 3,0 + 1,0 rizshal Oryzias latipes szivárványos guppi Poecilia reticulata kékkopoltyús naphal Lepomis macrochirus szivárványos pisztráng* Oncorhynchus mykiss 13–17 5,0 + 1,0 * Kezdőoldali képen

Zebrahal, Brachydanio rerio Forrás: http://blogs.nature.com/nm/spoonful/2008/03/

A teszthal A vizsgálatokhoz egy vagy több faj is alkalmazható. A teszthez használt halfajtákat gyakorlati kritériumok alapján érdemes megválasztani: egész évben könnyen beszerezhető legyen, problémamentesen fenntartható legyen, a vizsgálat céljainak megfelelő legyen, továbbá figyelembe kell venni minden olyan gazdasági, biológiai vagy ökológiai tényező, amelynek bármilyen hatása lehet. A halaknak jó egészségi állapotban kell lenniük, és mindenfajta látható testi hibától mentesnek kell lenniük

A teszthal 2. A halakat legalább 12 nappal a vizsgálat megkezdése előtt be kell szerezni és a laborban fenntartani. A vizsgálatot megelőző hét napban olyan minőségű vízben kell tartani a halakat, amilyenben a teszt is zajlani fog és az alábbi feltételeknek kell teljesülni: világítás: napi 12–16 órás megvilágítás, hőmérséklet: az adott fajnak megfelelő oldott oxigén koncentrációja: a levegőtelítettségi érték legalább 80 %-a, etetés: háromszor hetente vagy naponta, 24 órával a teszt megkezdése előttig

Szivárványos guppifajták: Poecilia reticulata Forrás: http://diszhalak-oldala.hupont.hu/11/megtobb-kep

Méréshez szükséges készülékek Minden készüléket kémiailag inert anyagból kell készíteni: oxigénmérő, vízkeménység meghatározására szolgáló berendezés, megfelelő készülék a hőmérséklet szabályozásához.

Hasznos információk a vizsgált anyagról az anyag vízoldékonysága gőznyomása kémiai szerkezete az anyag tisztasága kémiai stabilitása disszociációs állandói biológiai lebonthatósága A fentiek fontos információk annak érdekében, hogy a legmegfelelőbb vizsgálati módszert lehessen kiválasztani (statikus, félstatikus vagy átfolyásos módszer) és a vizsgálat időtartama alatt a vizsgált anyag kielégítően állandó koncentrációja biztosítható legyen.

Vizsgálat érvényessége Ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen, a következő feltételeknek kell teljesülniük: A kontrollcsoportban a kísérlet végéig a halpusztulásnak nem szabad 10%-nál nagyobbnak lennie (vagy maximum egy hal pusztulhat el, ha tíznél kevesebb halat használnak). Állandó feltételeket kell fenntartani amennyire csak lehet az egész vizsgálat során, és ha szükséges, félig statikus vagy átfolyásos eljárásokat kell alkalmazni. Az oldott oxigén koncentrációjának mindvégig nagyobbnak kell lennie, mint a levegőtelítettségi érték 60%-a. A vizsgált anyag koncentrációit a kísérlet során mindvégig a kezdeti koncentráció 80%-án belüli értéken kell tartani.

Kékkopoltyús naphal: Lepomis macrochirus Forrás: http://www.cacaponriver.org/news/newsletter2003-3.htm

A vizsgálat menete

Alkalmazandó módszer meghatározása Típusát tekintve háromféle eljárás használható: Statikus vizsgálat: Ez olyan toxicitásvizsgálat, amelyben a vizsgált oldat nem áramlik (az oldatok mindvégig változatlanok maradnak). Félstatikus vizsgálat: A vizsgált oldat áramlása nélküli vizsgálat, amelynél rendszeresen, adagonként ki kell cserélni a vizsgált oldatokat hosszabb időtartamok (pl.: 24 óra) eltelte után. Átfolyásos vizsgálat: Olyan toxicitásvizsgálat, amelyben a vizet állandóan cserélik a vizsgálati kamrákban.

Hígítási sor elkészítése El kell készíteni a szükséges erősségű törzsoldato(ka)t majd a vizsgálni kívánt koncentrációkat a törzsoldat hígításával kell elkészíteni. A hígításhoz használható jó minőségű természetes víz vagy művíz illetve ivóvíz is, melynek keménysége 10 és 250 mg/l közötti (CaCO3-ra meghatározva), pH-ja pedig 6,0 és 8,5 között van. Ultrahangos diszpergálás, szerves oldószerek, emulgeáló- vagy diszpergálószerek használhatók alacsony vízoldékonyságú anyagok törzsoldatainak elkészítéséhez. Valamilyen segédanyag használata esetén, a kontrollhalakat is ki kell tenni a segédanyag ugyanolyan koncentrációjának, mint amelyet a vizsgálati sorozatokban alkalmaztunk. Segédanyag maximum koncentrációja:100 mg/liter a vizsgált közegben. A vizsgálatot a pH-érték beállítása nélkül kell végrehajtani. Ha létezik bizonyíték a pH-érték jelentős változására, ajánlatos a vizsgálat megismétlése a pH-érték beállításával.

Teszt-körülmények Teszt időtartam: 96 óra, állatok száma: koncentrációnként és a kontrollban is legalább 7 egyed egyedsűrűség: 1 g hal/liter ajánlott a statikus és a félstatikus vizsgálatokhoz; az átfolyásos rendszerekhez elfogadható ennél nagyobb egyedsűrűség is vizsgált koncentráció: legalább 5 olyan koncentráció esetén szükséges a vizsgálat, amelyek mértani sorozatának tényezője nem haladja meg a 2,2-et és szükséges a kontroll minta vizsgálata is világítás: 12–16 órás megvilágítás naponta, hőmérséklet: a használt fajtáknak megfelelő, de minden esetben ± 1 °C-on belül, oldott oxigén koncentrációja: a levegőtelítettségi érték nem kevesebb, mint 60 %-a, levegőztetés használható, ha nem okoz veszteséget a vizsgált anyag mennyiségében etetés: nincs zavarás: a halak viselkedését befolyásoló tényezőket ki kell zárni.

Észrevételek A halakat a teszt megkezdését követő 3. és 6. órában, majd 24., 48., 72. és 96. órában meg kell vizsgálni, a pusztulásokat feljegyezni és az elpusztult halakat el kell távolítani. A halak akkor tekinthetők élettelennek, ha a farokúszó érintése nem vált ki reakciót, és nem látható semmilyen mozgás. Nyilvántartást kell vezetni a látható rendellenességekről (például egyensúlyvesztés, az úszási viselkedés és a légzés változásai, pigmentáció stb.). Naponta mérni kell a pH-értéket, az oldott oxigén koncentrációt és a hőmérsékletet.

Adatok értékelése Minden olyan időtartamhoz, amikor fel lettek jegyezve megfigyelések (24, 48, 72 és 96 óra) meg kell határozni a kontrollhoz viszonyított százalékos pusztulásokat, majd ezt a koncentráció logaritmusának függvényében fel kell rajzolni. H=pusztulási/letlitási százalék(%) N k=a kontrollban életben maradt állatok száma(db) Nminta =a mérendő mintában életben maradt állatok száma (db) Minden egyes megfigyelési időhöz meg kell becsülni az LC50-et (50%-os pusztuláshoz tartozó koncentráció) és a hozzá tartozó (p=0,95) megbízhatósági tartományt.

Rizshal és rizshal-embriók: Oryzias latipes Forrás: http://www.biol.s.u-tokyo.ac.jp/users/hassei/English/research%20E/research%20E.html

Forrás: OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 203 – Fish, Acute Toxicity Test Kép: http://1.bp.blogspot.com/_AamNOe-sLvQ/SXeIcwHoltI/AAAAAAAAACM/bvmpPvTKq4o/s320/Szivárványos+pisztráng.png