Proteomika Készítette: Ratuszni Róbert Attila Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2011

Fogalmak: Proteom: A sejtben adott időpontban a genom által expresszált fehérjék összessége. Proteomika: A szervezet teljes fehérjeállományának mennyiségi és minőségi analízise, a különböző fajokból, fajtákból származó proteomok összehasonlítása; a proteom összetételének vizsgálata különböző körülmények között, új, a fenti problémák megoldását elősegítő eljárások és azok kutatása. (Talajvizsgálat esetében, az adott talajmintában található összes fehérje vizsgálatát értjük alatta.)

A proteomika céljai: Az igen kis mennyiségben, illetve koncentrációban jelen lévő fehérjék kimutatása, azonosítása, szerkezetük meghatározása. A fehérjékkel kapcsolatos taxonómiai, szerkezeti vagy funkcionális jellegű ismeretek rendszerezése. A proteom (teljes fehérjeállomány) tanulmányozása.

A proteomikai kutatások menete: (ismert gazdaszervezet esetén)

A fehérjekomponensek izolálása (1): A sejtekben jelen levő fehérjék jelentős része a citoszolban oldott állapotban található, de nem elhanyagolható a sejtorganellumokban, membránban rögzített protein mennyisége sem. Ahhoz, hogy tiszta, szerkezet- és funkcióvizsgálatokra alkalmas fehérjéhez jussunk, először a sejtek struktúráltságát kell megszüntetni. Struktúláltság megszüntetése: különféle detergensekkel, a hőmérséklet drasztikus emelése vagy csökkentése egyaránt alkalmas sejtlizátumok előállítására.

A fehérjekomponensek izolálása (2): Probléma lehet, hogy a lízis következményeként az addig „ellenőrzés alatt álló” enzimek (proteázok, foszfatázok stb.) aktivitása kontroll nélkülivé válik, és elindul a fehérjék degradációja. Például a lizoszómákba zárt enzimek térbeli elkülönülése a membránstruktúra felbomlásával megszűnik. A fehérjék enzimkatalizálta hidrolízise, részleges lebomlása azt is jelentheti, hogy olyan vegyületek is megjelennek a lizátumban, amelyek az élő sejtben nem fordulnak elő.

Lehetséges vizsgálati módszerek: Elektroforézis + fehérje-tömegspektrometria (2D-GE + MALDI-TOF MS) Röntgenkrisztallográfia MALDI MS

2D-gélelektroforézis (1): Izoelektomos fókuszálás: a fehérjék addig vándorolnak egy pH grádiensben, amíg elérik izoelektromos pontjukat, ahol töltésük nulla, így az elektromos tér nem hat rájuk. (A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően.) Ezután az izoelektromos fókuszálással elválasztott fehérjék molekulatömegük szerint kerülnek a második lépésben ismét elválasztásra.

2D-gélelektroforézis (2):

Tömegspektormetria (1): A tömeg spektrográfiában a molekulát ionizálják, és megállapítják a mozgás sebességét egy elektromos térben. A töltés és a mozgás hányadosa jellemző a molekulára. A tisztított fehérjét proteázzal peptidekre bontják, ezek MS vizsgálata jellegzetes profilt eredményez. A profil alapján adatbázisból kikereshető a peptid aminosav sorrendje. A tömegspektrográffal a fehérje mennyiségéről is nyerhető adat.

Tömegspektormetria (2):

A vizsgálat menete:

Röntgenkrisztallográfia: A röntgendiffrakció rendezett, kristályos felépítésű anyagok szerkezetének felderítésére alkalmas módszer. Azon alapszik, hogy az atomok mérete és a röntgensugár hullámhossza lényegében megegyezik.

Talajvizsgálati vonatkozások: A talajból nyert fehérjék elemzésével képet kaphatunk a talajlakó élőlények mennyiségéről, illetve a diverzitásról is. A kapott eredmények alapján segíthetjük a biológiai, természetvédelmi kutatásokat, illetve további vizsgálatok szükségességét is kimutathatjuk.

Mikrobiológiai vonatkozások: Ha különböző táptalajon tenyésztünk azonos mikroorganizmust, akkor a táptalajokból nyert fehérjék összehasonlításával megvizsgálhatjuk az egyes komponensek hatását az adott tesztorganizmusra, hiszen a különböző táptalajokból különböző mennyiségű, esetleg minőségű fehérjéket fogunk kimutatni. Az expressziós profilok elemzésével következtethetünk például gyógyszervegyületek, vagy környezetszennyező anyagok hatására.

Források: Hudecz Ferenc - Proteomika, az új kihívás ( Szegedi Tudományegyetem Genetikai Tanszék - Genomika (előadás) ( Aladics Ágnes - 2D gélelektroforézis és a tömegspektrometria (előadás) ( pt) Dr. Boross Péter - Kétdimenziós gélelektroforézis és nagy-áteresztőképességű mintaelőkészítő rendszer alkalmazása a proteomikában (előadás) ( df) Matus Marietta - Röntgenkrisztallográfia, röntgendiffrakció (előadás) ( 2/R%F6ntgenkrisztallogr%E1fia.ppt) Képek: tortenete/

Köszönöm a figyelmet!