AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE

AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz lánc (H) VL CL VH CH

Mieloma multiplex Plazmasejt tumorok – tumorsejtek a csontvelőben Monoklonális eredetű emberi immunoglobulinok a szérumban (50-100mg/ml) Rodney Porter és Gerald Edelman 1959 – 1960 fehérje tisztítás AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE 50 kDa Nehéz lánc 25 kDa Könnyű lánc Gél elektroforézis V ariábilis C onstans Redukció L H

AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE VL VH A sokféleség kialakulásának mechanizmusa? Más szabályok a variábilis és konstans régiók kialakulására? Szimmetrikus molekula  két azonos VH és VL  mindkét kromoszóma ugyanazt a szekvenciát kódolja? S – S

Sok GÉN ( – ) V2V2V2V2C V3V3V3V3C V1V1V1V1C 1 GÉN magas szomatikus mutációs ráta a V régióban VC GénGénGénGén Protein 1 GÉN = 1 FEHÉRJE A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA AZ IMMUNOGLOBULIN SZEKVENCIA JELLEGZETESSÉGE ELMÉLETEK

AZ IMMUNOGLOBULINOK MOLEKULÁRIS GENETIKÁJA Az egyetlen C régiót kódoló gén a csíravonalban el van választva a V régió génektől A V génekből többféle áll rendelkezésre Feltételezhető egy mechanizmus, amely a V és C géneket fúzionálja egy teljes immunglobulin génné Dreyer & Bennett feltételezése (1965) Egy adott izotípusú ellenanyag valószínűleg: Hogyan magyarázható az ellenanyagok kettős funkciója? A feltételezés ellentétben állt az akkor elfogadott nézettel, amennyiben a DNS (genetikai állomány) egy adott egyed minden sejtjében azonos

A Dreyer - Bennett hipotézis V V V V V V V V V V V V V A B-sejtekben a V és C géneket valamilyen mechanizmus egy teljes immunglobulin génné fúzionálja C V C A csíravonalban egyetlen C gén van (L-lánc), amely a sok V géntől távol helyezkedik Módszer a sok V gén létezésének és a V – C gén átrendeződés igazolására

Módszer Megközelítés: Specifikus cDNS próbák a különböző V régiók és a C régiók elkülönítéséhez DNS restrikciós enzimek a DNS fragmentáláshoz A csíravonalból (pl. méhlepény) és az érett B-sejtekből (pl. plazmocitóma/mielóma) származó DNS C V V V V V V V V V Csíravonal DNS C V V V V V Átrendezett DNS

Susumu Tonegawa kísérlete 1976 ** * * * B-sejt VC V C Embrionális sejt V-CmRNS próba CmRNS próba * *

Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén VCVVV CSÍRAVONAL A V és C gének csak a B-sejtekben kerülnek egymás mellé C V VV B-SEJT KÖVETKEZTETÉSFehérje GénGénGénGén GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE EGY GÉNNÉ

Az Ig gének szekvenálása tovább bonyolította a képet A csíravonal VL gének szerkezete hasonló volt a V  és and V könnyű láncok esetében A csíravonal és az átrendezett DNS nem volt azonos Honnan származik a 13 extra aminosav? CLCL VLVL ~ 95as~ 100as L CLCL VLVL ~ 95as~ 100as JLJL Az aminosavak egy része a kis számú J (Joining) régiókból származik L CLCL VLVL ~ 208as L

B-limfocita fejlődés során JkJκJκJκJκJκJκVκVκVκVκVκVκ B-sejt 1 JκJκVκVκ B-sejt 2 40 Vκ 5 Jκ5 Jκ5 Jκ5 Jκ VκVκVκVκVκVκVκVκ JκJκ JκJκ JκJκ JκJκ Csíravonal A KAPPA (κ) LÁNC GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE DNS

pACk E JJ VkJk VkVκVκ P Primer RNS átirat Ck E JJVk Ck J Fehérje mRNACk J AAAA Transzláció A K-LÁNC KIFEJEZŐDÉSE A szomatikus génátrendeződés hatékonysága

Az Ig könnyű lánc átrendeződés: Menekülési út A könnyű lánc gének esetében a V – J régió közti kapcsolat kialakulásakor a megfelelő keret leolvasásnak csak 1:3 az esélye 1 helyes keret leolvasás VV JJ CC Nem-produktív átrendeződés Hasított mRNA átirat A könnyű lánc esetében új V és J elemek részvételével még egy esély van a produktív átrendeződésre

Az Ig H lánc további sokféleséggel jellemezhető VLVL JLJL CLCL L CHCH VHVH JHJH DHDH L A nehéz lánc a VH és JH gének közötti szakaszon további (0 – 8) aminosavat tartalmaz Ezek a D (DIVERSITY) régióból származnak A könnyű lánc kialakulásához 1 rekombinációs folyamatra van szükség : V L to J L A nehéz lánc kialakulásához 2 rekombinációs folyamatra van szükség D H to J H és V H to D H J H,

A B sejt fejlődés során 65 VH 6 JH VH1VH3 DJH 27 D DDD JH DD A VH GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE DD VH1VH2VH3 VH1VH2 JH

VH D JH VLJL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL AZ ANTIGÉN RECEPTOROK SOKFÉLESÉGE Egy egyed különböző B limfocitái 1234

AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK SZÁMA Variábilis (V) Diverzitás (D)0027 Kapcsoló (J)546 Gene segmentsKönnyű láncNehéz lánc kappalambda Chromosome 2 kappa light chain gene segments Chromosome 22 lambda light chain gene segments Chromosome 14 heavy chain gene segments AZ IMMUNOGLOBULIN POLIPEPTID LÁNCOKAT TÖBB GÉN SZEGMENS KÓDOLJA AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ELRENDEZŐDÉSE

Hogyan működik a szomatikus rekombináció ? 1.Hogyan jön létre a végtelen számú sokféleség a korlátozott számú gén szegmensek részvételével? Kombinációs sokféleség

A kombinációs sokféleség becslése A funkcionális V, D és J gének száma: 65 VH x 27 DH x 6JH = 10,530 kombináció 40 V  x 5 J  = 200 kombináció 30 V  x 4 J = 120 kombináció = 320 különböző könnyű lánc Amennyiben a H és L láncok véletlenszerűen párosodnak mint H 2 L 2 10,530 x 320 = 3,369,600 lehetőség Csak a KOMBINÁCIÓS sokféleség A valóságban bizonyos H + L kombinációk nem fordulnak elő, mert instabilak Bizonyos V és J gének gyakrabban fejeződnek ki, mint mások A KAPCSOLÁSI sokféleség tovább növeli a szekvenciák számát A POTENCIÁLIS B-SEJT KÉSZLET KIALAKULÁSA

A D szegmens 3 keretben olvasható GGGACAGGGGGC GlyThrGlyGly GGGACAGGGGGC GlyGlnGly GGGACAGGGGGC AspArgGly A D regió különböző ellenanyagokon végzett analízise azt mutatta, hogy ugyanaz a D régió mindhárom keretben leolvasható, ami eltérő fehérje szekvenciát és ellenanyag specificitást eredményez Keret 1 Keret 2 Keret 3

Hogyan működik a szomatikus rekombináció ? 1.Hogyan jön létre a végtelen számú sokféleség a korlátozott számú gén részvételével Kombinációs sokféleség 2.Hogyan találja meg a V régió a J régiót és miért nem a C régióhoz kapcsolódik ? szabály

23-mer = két fordulat 12-mer = egy fordulat A szabály molekuláris magyarázata Rekombinációs szignál szekvenciák RSS Közbeeső, bármely hosszúságú DNS 23 V DJ7 9

A V, D, J gén szegmenseket határoló szekvenciák V A V, D és J elemek előtt konzervált nukleotid szekvenciák helyezkednek el, amelyek mindig 7, 23, 9 és 12 nukleotidból állnak és a lókuszra jellemző elrendeződést mutatnak VV JJ J D VHVH JHJH 7 9

Recombinációs szignál szekvenciák (RSS) SZABÁLY – A 23mer által határolt gén szegmens csak a 12mer RSS határolt gén szegmenssel tud kapcsolódni VHVH D JHJH HEPTAMER – Mindig folytatólagos a kódoló szekvenciával NONAMER – A heptamertől 12 vagy 23 nukleotid választja el VHVH D JHJH 

23-mer 12-mer A közbeeső DNS hurok kivágódik A heptamerek és nonamerek visszafelé illeszkednek Az RSS által kialakított alakzat a rekombinázok célpontja V1 V2 V3V4 V8 V7 V6 V5 V9 DJ V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V9 Két 23-mer vagy két 12mer nem tudja kialakítani a megfelelő alakzatot A szabály molekuláris magyarázata

23-mer 12-mer V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V RAG complex kötődik és hasítja a rekombinációs szignál szekvenciát ami hajtű képződést eredményez A hajtű RAG-közvetítette hasítása palindróm szekvenciákat eredményez A REKOMBINÁCIÓ KÖVETKEZMÉNYEI

23-mer 12-mer Loop of intervening DNA is excised V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V N-nucleotid hozzáadást TdT enzim által A páratlan nekleotidok eltávolítása exonukleázok révén A hiányzó nukleotidok hozzáadása DNS szintézissel, ligálás kódoló szekvenciává Pár képződés