A primer congenitalis glaucoma (PCG) aktív esetfelkutatásai és géndiagnosztikája Béres J, Vas Sz, Kalmár L, Sényi K, Andrikovics H, Tordai A OSZMK VRONY NETT XIX. Nemzetközi Kongresszusa Győr 2011. április 26-27

Glaucoma(zöldhályog) Fokozott szembelnyomással járó kórkép, következménye: a látóideg progresszív károsodása, fokozatos látótércsökkenés Felnőtt lakosság 2%-a érintett Primer vagy szekunder Nyílt vagy zárt zugú Felnőttkori, gyermekkori és fiatal felnőttkori ill. veleszületett Genetikai háttér

PCG (buphtalmos) Abnormális trabekuláris hálózat (IOP↑) Öröklődés Autoszómális recesszív, de pszeudodominancia! Genetikai heterogenitás GLC3A (2p21,CYP1B1), GLC3B (1p36), GLC3C (14q24.3-q31.1) MYOC Fenotípusos heterogenitás Penetrancia változó (40-100%) (Bejjani, 2000) Földrajzi különbségek Nyugati országok: 1:10.000-20.000 Közel-Kelet: 1:2500 (Francois et al. 1980) Szlovák cigányok: 1:1250 (Gencik et al. 1982) A glaukóma komlex neurodegeneratív betegségcsoportot takar, 2010-ben kb. 60 millió beteget érintett világszerte. A hasonló fenotípus mögött (retinális ganglionsejtek csökkenése, a látótér tipikus megváltozása, és a szemideg degenerálódása) a genotípusban is átfedéseket találunk. Veleszületett típus a PCG, több mint 80%-ban manifesztálódik az 1. életévben. OK: fejlődési rendellenesség a trabekuláris hálózatban és az elülső szemcsarnokban. Autoszámális recesszív módon öröklődik, de egyes belterjesebb népcsoportokban pszeudodominanciáról is beszámoltak, amikor minden generációban megjelennek a beteg fenotípusok. Kapcsoltsági vizsgálatokkal 3 lókuszt azonosítottak, ezek közül csak a GLC3A-hoz köthető CYP1B1 gént sikerült a betegséggel összefüggésben azonosítani. Prevalenciában jelentős földrajzi különbségek vannak: nyugati országokban előfordulása 1:10-20.000, addig pl. szlovák romáknál 1:1250

CYP1B1 - metabolizál: karcinogének, szteroidok, retinolsav, melatonin CYP450 szupercsalád tagja - metabolizál: karcinogének, szteroidok, retinolsav, melatonin a szemben ill.15 egyéb humán szövetben előfordul rekombinációs eseményekre hajlamos növekedésben és differenciálódásban is részt vesz (szem ?) Exon 1 Exon 2 Exon3 5’ 3’ A PCG genetikai hátterében álló CYP1B1 gén a CYP450 (kevert funkciójú monooxigenáz, dioxinnal indukálható) szupercsalád tagja, amely enzimek a fázis I reakciókban vesznek részt. (humánban 58 tag közül ez volt a első, amelyet egy veleszületett betegséggel hoztak összefüggésbe). Ez az gén számtalan szövet sejtjében megtalálható, pl. szem, ill. vese csatornák, mell mirigy sejtjeinek sejtmagjában. 82 mutációt írtak le eddig, ezek harmada inzerció-deléció -> rekombinációs eseményekre hajlamos 543 aminosavból álló peptidet határoz meg a gén. - Membránkötött N-terminális régió 53 as-ból áll HINGE: 10 as-ból álló prolin-gazdag régió a citoplazmában elhelyezkedő 480 as-ból álló globuláris domain K-hélix H-hélix hinge régió I-hélix L-hélix J-hélix hem-kötő régió meander

A CYP1B1 szembetegségekben Kandidáns gén: PCG, Péter anomália, Rieger anomália aniridia, írisz hypoplasia, … Ritkán kandidáns: POAG-ban Módosító: POAG-ban (MYOC) JOAG A CYP1B1 fehérje a szemen belül sugártest elülső részében, a sugártest nem pigmentált epitéliumában, a szivárványhártyában és a csarnokzugi hálózatban fejeződik ki. Szerepe szemben nem teljesen ismert. Feltételezhetően olyan zsírsavak, illetve szteroidok metabolizmusában vesz részt, amelyek elengedhetetlenek a szem működéséhez. A gén mutációt írták le a köv. kórképekben: PCG és egyéb anterior szegmenset érintő fejlődési rendellenességekben Egyes családokban a POAG együtt szegregálódik a PCGvel -> a 2 glaukóma forma pathomechanizmusa átfed és a CYP1B1-nek szerepe lehet. A CYP1B1 és MYOC gén „két génes öröklődését” is leírták olyan családban, ahol a MYOC mellett a CYP1B1 mutációja együtt fordult elő, itt a fenotípust súlyosbító módosító lókuszként fordult elő.

(enzimmel történő emésztés, gélelektroforézis) Módszerek 1. – PCR-RFLP (enzimmel történő emésztés, gélelektroforézis) 178 bp PCR-termék 29 bp 129 bp 20 bp konstans hasítási hely hasítási hely a normál allélen 1 2 3 4 5 6 Polimerase chain reaction – restrinkciós fragmentum hossz polimorfizmus, etidium bromiddal festett agaróz gélben elektroforézis alkalmazása, rövidebb hasítási termékek gyorsabban haladnak. Pontmutációk kimtatására Exon fragmenseket nagy mennyiségben amplifikáljuk, majd restrinkciós enzimekkel hasítjuk Létrát célszerű használni a kapott hasítási termékek azonosítására. 1 - emésztetlen PCR-termék 2,3 - Homozigóta normal genotípus 4 - Heterozigóta genotípus 5 - Homozigóta mutáns genotípus 6 - Molekulatömeg marker 252 bp 186 bp 3% agaróz gél, ethidium-bromide festés

Módszerek 2.- szekvenálás Abi prism 310 kapillárisszekvenátor segítségével a kódoló régiók teljes nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, majd azt a normál szekvenciával összehasonlítva felderítettük a mutációkat és a polimorfizmusokat is

Eredmények- populációgenetika Glu387Lys mutáció gyakorisága egészséges magyarországi romák között (PCR-RFLP) Vizsgált romák száma Allélfrekvencia (%) Hordozó-gyakoriság (%) Észak-Magyarország 207 1,5 3 Dél- Magyarország 150 Összevetés irodalmi adatokkal (Plasilova et al.1999) Szlovák romák 158 5 10 Az E387K mutáció a CYP1B1 fehérjében lévő K-hélixet érinti, amely a helyes konformáció kialakításában, és a hem kötő aktivitásban vesz részt. Nagyon konzervált régió, így ennek a megváltozása súlyos és nem variáblis fenotípussal jár együtt. Plasilova szlovák cigányokban 3,33×-os allélfrekvenciát talált.

Eredmények- mutációk + 100% _ 33 % Roma szárm. CYP1B1 mutáció CYP1B1 gén kódoló szakaszaiban talált mutációk Roma szárm. CYP1B1 mutáció Betegség-kezdet 9 beteg Glu387Lys/Glu387Lys + 100% születéskor 3 beteg Met1Thr/Gly61Glu g.4673insC/g.7901_7913 g.4673insC/g.4340delG _ 33 % 2 beteg g.7901_7913/- Glu229Lys/- 6 hónapos ! 7 beteg -/- Születéskor Kivétel: 1 (6 hónapos) Össz: 21 A 24 betegből 3 kivételével (2, 3 éves betegségkezdet + 1 akinek nem tudjuk), marad 21 beteg.

Eredményeink összevetése irodalmi adatokkal PCG beteg CYP1B1 mutáció Szlovák romák (Plasilova, 1999) n=43 100% Magyar romák (jelen vizsg., 2003) n=10 100% Arabok (Bejjani, 2002) n=62 92% Európaiak (Sitorus, 2003) n= 9 11% Magyarok (jelen vizsg., 2003) n=14 21% Brazilok (Stoilov, 2002) n=52 42% Japánok (Mashima, 2001) n=65 17%

Összefoglalás A PCG genetikai háttere hazánkban élesen elkülönül roma és nem roma betegek esetében (Glu387Lys) Az északi és déli romapopuláció között a Glu387Lys allélgyakoriságban különbség Nem roma betegek esetében a CYP1B1 csupán 33%-ban volt felelős a betegségért Egyéb lókuszok szerepe Összefoglalásként újból hangsúlyoznám, hogy a romák esetében a PCG hátterében kizárólag egyetlen mutációt találtunk, ennek azonosításához (esetleg szűréséhez) egyetlen PCR-RFLP teszt elegendő. Haplotípus vizsgálattal megerősítettük ezen mutáció alapító voltát. Szignifikánsan különbözött az É és D magyarországi roma populáció ezen mutációt hordozó allél frekevniájában, amely a 2 populáció eltérő eredetét sugallja. Nem romák esetében egyéb lókuszok, gének szerepe jöhet számításba.

Hogyan tovább? További betegek vizsgálata CYP1B1-re Egyéb gének vizsgálata (MYOC, …) Kapcsoltsági vizsgálatok (családok) Fenotípus-genotípus összefüggések keresése (mért paraméterek) A továbblépés kétségetelenül az volna, ha a nem roma betegek genetikai hátterét is azonosítani tudnánk. Ez a CYP1B1 génen kívüli egyéb gének vizsgálatát jelentené, ill. több generációs családok esetében kapcsoltsági vizsgálatok elvégzését, amellyel beazonosítható az a lókusz, ahol a „bűnös” gén van. A meglévő genotípusok fenotípusos adatokkal való kiegészítése/összevetése lehetőséget adna olyan (pl. pontszámokkal történő) összehasonlító vizsgálatokra, amellyel egy-egy mutáció pathogén hatása jellemezhető volna, pl. a prognózis. Ebben valószínűleg nehézségként merülhet fel: a származás, rokonházasság be nem vallása, nehéz a betegek követése, ill. nehezen ítélhető meg egy fenotípus, ha az orvos utasításait nem követik. Problémák: Származás, rokonházasság beteg követése compliance

Megtisztelő figyelmüket KÖSZÖNÖM