Időfelbontásos lézerspektroszkópia Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata Ha több fluoreszkáló komponens van, ezek elválasztása

Ha egy fluoreszkáló anyagot besugározunk, bizonyos számú molekula gerjesztődik amikor a sugárzást megszüntetjük, a molekulák fokozatosan visszakerülnek az alapállapotba. Ált. 1. rendű kinetika: N(t): gerj. molekulák száma a besug. után t idővel kR: sugárzásos átmenet seb. állandója kNR: sugárzásmentes átmenet seb. állandója

Integrálva: Exponenciális lecsengés A fluoreszcencia-intenzitás arányos N-nel.

Fluoreszcencia-intenzitás az idő függvényében a) Az impulzus rövid a lecseng. időáll.-hoz képest I0/e I0 I gerj. imp.

t lnI a tga = -t/t

Elvileg egyszerű, de a jel-zaj viszony szempontjából kedvezőtlen! (l. nemsokára)

b) Az impulzus hossza összemérhető a lecseng. időáll.-val Négyszög-impulzus (folyt. lézerből fényszaggatóval) lézer-intenzitás N(t)

10.1. Viszonylag hosszú időállandók (ms) meghatáro-zása - foszforeszcencia - ritka földfémek emissziója I: Folytonos lézer + fényszaggató + boxcar vagy elektrooptikai modulátor vagy akusztooptikai modulátor II: Lézeres villanófényfotolízis

Megvalósítás I: boxcar-os rendszerrel folytonos lézer monokro- mátor PMT boxcar regiszt- ráló minta fényszag- gató

Miért kedvezőtlen a nagyon rövid gerj. impulzus? Kevés molekula gerjesztődik! lézer-intenzitás N(t)

10. Villanófény-fotolízis

Villanófény-fotolízis

Foszfolipid vezikula kettősrétegében oldott porfirin triplett lecsengése oxigén jelenlétében.

Foszfolipid: sejtmembránokban található anyagok, hidrofil „fejjel” és lipofil „farokkal”

Egy foszfolipid vezikula (idealizált) szerkezete, feltüntetve az apoláros próbamolekula legvalószínűbb helyét.

Triplett antracén abszorpciós spektruma A: hexánban, B: DMPC vezikulában 25oC-on, C: DMPC vezikulában 18oC-on.

Szingulett oxigénnel reagáló akceptor fogyása az akceptor abszorbanciájának mérésével.

A szingulett oxigén IR emissziós jele hematoporfirin szenzibilizátor jelenlétében. A megvastagított vonal extrapoláció.

11. Időfelbontásos fluoreszcencia- spektroszkópiai módszerek 11.1. Időkorrelált egyfoton-számlálás: egy fényimpulzus gerjeszti a mintát, és a fluoreszcencia lecsengését vizsgáljuk az időben. 11.2. Fázismodulációs módszer: szinuszos intenzitás modulációt alkalmazunk, és a szintén szinuszos intenzitás eloszlású fluoreszcencia fázis-eltolódását vizsgáljuk. (Pumpa módszerek: külön tárgyaljuk Tulajdonképpen az impulzusos módszerhez tartozik.)I

11.1.Időkorrelált egyfotonszámlálás Mérőrendszer minta impulzuslézer monokromátor trigger START analóg-digitál átalakító számítógép idő-ampl. átalakító PMT STOP

A fényforrás impulzuslézer START jel – lézernek és elektronikának Triggerrel vagy: Az impulzus egy részét fényosztóval kicsatoljuk. Fotodetektorra kerül, ez adja az elektronika indítóimpulzusát (A lézerimpulzus másik része a mintára kerül) Az indítóimpulzus az idő-amplitúdó átalakítón elindít egy feszültség-növekedést.

Idő-amplitúdó átalakító U t STOP START

A mintából eredő lumineszcencia PMT-re kerül Úgy állítjuk be a gerj. fény intenzitását, hogy egyetlen foton váltson ki áramot a fotokatódon. Amikor a PMT-ből származó impulzus eléri az idő-amplitúdó átalakítót, megáll U növekedése. A kialakult jel arányos az eltelt idővel (a fluoreszc. időkésésével). Sok ezer, vagy 10ezer fényimpulzus után mérjük az első foton érkezési idejét Többcsatornás analizátorral dolgozzuk fel.

gyakoriság csatornaszám (idő)

A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp. hosszával  Dekonvolúció E(t): a lézerimp. és a készülék együttes profilja F(t): a fl. lecsengése L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója)

I(t) t E(t) L(t)

Níluskék festék fluoreszcencia-lecsengése toluolban

F 11.2. Fázismodulációs módszer Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk. F Int. t fluoreszcencia

Fázismodulációs mérőrendszer Folytonos lézer Modulátor Minta Monokromátor PMT Lock-in ( fázisérzékeny detektor) Referencia jel szűrő

Két mérési eredményből is számítható Fázisszögből: Demodulációból:

12. Pumpa-próba elvű módszerek Elsősorban impulzuslézerrel. A mintára intenzív impulzust bocsátunk (pumpaimp.). Molekulák egy része gerj. állapotba kerül. A később érkező próbaimpulzus „észleli” a változást. Időkésleltetés: optikai úthossz megnövelésével. A fény 1 ns alatt 30 cm-t 1 ps alatt 0,3 mm-t tesz meg.

Pumpa-próba mérés I: tranziens abszorpció mérése egy lézerrel

Próbanyaláb intenzitása Dt

Pumpa-próba kísérlet II: Tranziens abszorpció két lézerrel

Níluskék metanolos oldatának tranziens abszorpciója pumpa-próba módszerrel mérve (lpumpa = 586 nm)

Níluskék tranziens absz Níluskék tranziens absz. lecsengése vizes oldatban pumpa-próba módszerrel mérve (lpumpa = 586 nm, lpróba = 647 nm)

Pumpa-próba Módszer III: tranziens emisszió mérésére: „Fluorescence up-conversion” Femtoszekundumos folyamatok vizsgálatára használható

dikroikus tükör BBO saroktükör   Ti-zafír lézer 2 minta szűrő mono-kromátor F BBO +F szűrő PMT

DCM lézerfesték fluoreszcencia-lecsengése etilénglikolban Magyarázat: a kisebb hullámhosszakon gerjeszthető S2, S3 állapotokból töltődik fel az S1 P. van der Meulen, J.Phys. Chem. 100, 5367 (1996)

13-14. Lézer-Raman spektroszkópia A Raman-effektus már a lézerek felfedezése előtt ismert volt. 1922 Brillouin Fény és hanghullámok kölcsönhatása 1923 Smekal Raman-szórás elmélete 1928 Raman Kísérleti igazolás

TARTALOM 13.1. Hagyományos Raman-spektroszkópia 13.2. Rezonancia-Raman effektus 13.3. Felületerősített Raman-szórás 14.1. Hiper Raman-effektus 14.2. Stimulált Raman-effektus 14.3. Raman erősítési spektroszkópia 14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia Spektrumok

13.1 Hagyományos Raman-spektroszkópia A Raman-spektrum az IR és mikrohull. spektrum kiegészítője. Főleg rezgési és forgási spektrumok mérésére

A lézerek előtt a R-spektroszkópia fejlődését gátolta, hogy nem volt intenzív monokromatikus fényforrás. Főleg higanygőzlámpát használtak (a 254 nm-es vonalát). A lézerek leterjedése - minőségi ugrás

R-szórás: a foton rugalmatlan ütközése a molekulával. b a nL n s b a nL Stokes Anti-Stokes

Készülék: - Diszperziós: hasonló a spektrofluoriméterhez. Monokromátor: két rács (nagyobb felbontás kell) - Fourier-transzformációs Raman: monokromátor helyett interferométer

Diszperziós Raman-spektrométer

FT-Raman spektrométer álló tükör minta Nd-YAG lézer mozgó tükör fényosztó szűrők detektor FT-Raman spektrométer

Antracén Raman-színképe (A) Diszperziós Raman-készülék, exc=514,5 nm (B) FT-Raman készülék, exc=1064 nm Chase, J. Am. Chem. Soc. 108, 7486 (1986)

Raman és infra összehasonlítása Raman előnyei Vizes oldatok Optika üvegből Kisebb minta (fókuszálás) Detektor gyorsabb Raman-spektrum egyszerűbb Szimm. rezgések R-aktívak Polarizációs mérések Intenzitás arányos konc.-val Kis hullámszámok tartománya is mérhető Raman hátrányai Drágább R-spektrum készülékfüggőbb Infra érzékenyebb Fluoreszcencia zavaró hatása

Raman-mikroszkóp Búzaszem

Speciális Raman-módszerek 13.2. Rezonancia-Raman effektus Ha a Raman-átmenet felső szintje nem virtuális, hanem valóságos, akkor a Raman-intenzitás megnő. Ha a minta fluoreszkál, nehéz detektálni a Raman-jelet.

Emberi vér rezonancia Raman-színképe az O2 telítettség függvényében artériás vér: a) hemoglobin O2 telítettség 99 %, vénás vér: b) 78 %, c) 68 %, d) 26 % K. R. Ward, Anal. Chem. 79, 1514 (2007)

13.3. Felületerősített Raman-szórás (Surface Enhanced Raman Scattering - SERS) Érdes felületen adszorbeált molekulák Raman-intenzitása nagyságrendekkel nőhet.. Először Ag felületén adszorbeált piridinen észlelték 1974-ben. 6 nagyságrend érz. növekedés is elérhető. Akkor lép fel, ha a mintára lépő foton energiája megegyezik egy, a fémben lévő vezetési elektronenergia-átmenetével.

Furfural adszorpciója kolloid ezüstön Raman-színkép (a) oldatban, (b) kolloid ezüstön T.-J. Jia, J. Mol. Struct. (2007)

14.1. Hiper Raman-effektus: két foton egyidejű rugalmatlan ütközése DE = 2hnL -hnS b a nAS nL b a nL Stokes anti-Stokes

Frekvencia-kettőzés : hiper-Rayleigh szórás A hiper Raman-effektus nehezen észlelhető - nagy lézer-intenzitás kell. Mások a kivál. szabályok, mint a normál Ramanban. Olyan átmenetek is tanulmányozhatók, amelyek infra- és Raman-inaktívak.

14.2. Stimulált Raman-effektus virtuális E szint hnL hnS a b 2hnS

Véletlenül fedezték fel Véletlenül fedezték fel. Woodbury és Ng Rubinlézer Q-kapcsolását tanulmányozták. Nitrobenzolt tart. cella Kevesebb piros (694,3 nm) fény jött ki, mint várták. 766 nm-es koherens fényt találtak. A különbség megfelel a nitrobenzol 1350 cm-1 rezg. frekv.-jának.

Magyarázat: a kezdetben spontán Raman-emisszióval keletkező Stokes-fotonok a sugárzás irányában újabb Stokes-fotonokat váltanak ki. hnL hnS

A Stimulált Raman-effektuson alapul több nem-lineáris Raman-spektroszkópiai módszer. Önmagában nem terjedt el. Csak a legerősebb Raman-átmenetek figyelhetők meg - versengés.

Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük oszcillátor n L S generátor tükör "Raman lézer" er ősítő modell gyengül, ősödik Kísérleti megvalósítások Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük

14.3. Raman erősítési spektroszkópia „Stimulated Raman gain”: nS-t mérjük Inverz Raman: nL-t mérjük lézer nS nL detektor Dikroikus tükör minta

Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk) Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk). Felbontást a lézerek sávszélessége határozza meg. Inverz Raman: a nagyobb frekv. fényt detektáljuk - fluoreszcencia zavarásának kiküszöbölése Felhasználás: nagyfelbontású Raman spektroszkópia

5-CB folyadékkristály inverz Raman-színképe

Az 5-CB 1606 cm—es inverz Raman jelének intenzitása négyszögfeszültséget kapcsolva a mintára

14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia „Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy” CARS Négy foton vesz részt a folyamatban Kettőt elnyel, kettőt kibocsát a molekula Visszajut a kiind. energiaállapotba.

CARS alapkísérlet Imp.lézer folyadék nAS nL nL nL, nS

Nómenklatúra: nL  n1 nS  n2 nAS  n3

Energia-megmaradás: 2n1 = n2 +n3 Termdiagram n n L AS n n L 2 nS n n n 1 1 3 b a Energia-megmaradás: 2n1 = n2 +n3

Indexillesztés: Kondenzált fázisban a törésmutatók különböznek (l függvényében) Ha kollineáris sugarakat használunk, a jel nagyon gyenge. Impulzus-megmaradás törvényének is teljesülnie kell. Hullámvektor: Hullámszám az anyagban

Gázfázisban Folyadék-fázisban

A lézersugarakat a mintára fókuszáljuk

Berendezés vázlata

Spontán Raman és CARS összehasonlítása 106-108 foton kell egy szórt foton előállításához 102-103 foton elég Inkoherens, csak egy részét gyűjtjük össze Koherens, 90 %-os hatás-fokkal összegyűjthető Felbontást a mono-kromátor limitálja Felbontást a lézerek sáv-szélessége limitálja Jel ~ I12·I2·c2 Jel ~ IL·c

Spektrumok A kloroform Raman(a) és IR (b) spektruma

C60 FT-Raman spektruma

Kétatomos molekula rotációs energianívói: A spektroszkópiában gyakran cm-1-ben fejezik ki az energia-külöbségeket: Itt a fénysebességet cm/s-ban kell behelyettesíteni. B: rotációs konstans

J eJ 0 0 1 2B 2 6B 3 12B 4 20B Kiválasztási szabályok: DJ = 0,  2

Kétatomos molekula rotációs energia-nívói és a Raman-átmenetek

Kétatomos molekula Raman-spektruma

O2 tiszta rotációs inverz Raman-spektruma

O2 rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman-erősítési spektruma

SF6 rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman-erősítési spektruma