Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika In vitro sejtkultúrák használata a sejtműködés modellezésére: a műanyag előnyei és hátrányai Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium Elméleti PhD Iskola Kurzusa- Molekulától a betegágyig, sejttől a szervezetig 2011/2012 Tanév

Miért kutatunk? Az élővilág (köztük az ember) jobb megismerése Betegségek kialakulásának megismerése A gyógyítás lehetőségeinek megismerése MEGISMERÉS Megismerés = a valóság minél pontosabb leírása

A megismerés szintjei In vivo : Élő szervezetben végrehajtott vizsgálat Ex vivo: A nemrég még élő szervezet egy szervének az élőn kívüli, általunk jobban kontrollált vizsgálata In vitro: A valaha élő szervezet egy szövetének, sejtjeinek vizsgálata, a szervezettől merőben eltérő körülmények között In silico: A fentiek adatainak felhasználásával, számítógép segítségével történő modellezés Ex vivo és in vitro sokszor nem határolható el jól, sőt több alszintjük is lehet (sejt vs. sejtlizátum vs. tiszta fehérje). A sorrend a megismerés szempontjai szerint értendő.

A megismerés szintjei In vivo Ex vivo In vitro In silico Relevancia Variabilitás Kivitelezhetőség Etikai problémák Költségek Ex vivo és in vitro sokszor nem határolható el jól, sőt több alszintjük is lehet (sejt vs. sejtlizátum vs. tiszta fehérje). A sorrend a megismerés szempontjai szerint értendő.

In vitro sejtkultúrák Mi kell hozzá? Megfelelő sejt Sejttenyésztő tápfolyadék/táptalaj Sejttenyésztő edény Kontrollált körülmények – termosztát Kezeléshez sterilfülke (lamináris légáramlású) Hosszú távú tárolás (fagyasztás) In vitro sejtkultúrákhoz alkalmazkodó analitikai módszerek +szakmai gyakorlat, de az mindegyikhez kell

Megfelelő sejt kiválasztása Eredet (organizmus, szerv, szövet) Primer izolátum vs. immortalizált sejtvonal Hozzáférhetőség (nem csak egyszeri…) ? Tenyészthetőség (egyszerű vagy körülményes) Irodalmi adatok az adott sejtről (0 – 1 000 000) Eleve adott egy hipotézis, ehhez keresünk modell sejttípust Tapasztalataink hasonló sejtekkel? Fertőzési kockázat (a többi sejt/ kísérletező) Jó modellje-e a vizsgálandó folyamatnak?

Tápfolyadék – médium Különböző komplettségi szintek Minimum: Izotóniás sóoldat, pufferelt, cukor Rövid távú kísérletek, ahol a fehérjék zavarhatnak Normál: Izotóniás sóoldat, aminosavak, vitaminok, nyomelemek, cukor, glutamin (tápanyagként), szérum (borjú, vagy ritkábban fajazonos), növekedési faktorok, indikátor Általános sejttenyésztés Speciális: Szérummentes, többféle hormonnal, szérumfehérjékkel kiegészített normál médium, de receptje ált. üzleti titok Speciális körülményeket igénylő sejtek, kísérletek

Tápfolyadék – médium pH 4,0 7,4 9,0 Hank’s Balanced Salt Solution Inorganic Salts CaCl2•2H2O MgSO4 KCl KH2PO4 NaHCO3 NaCl Na2HPO4 OTHER D-Glucose DMEM KOMPONENSEK Inorganic Salts CaCl2 Fe(NO3)3 • 9H2O MgSO4 KCl NaHCO3 NaCl NaH2PO4 Amino Acids L-Arginine • HCl L-Cysteine • 2HCl L-Glutamine Glycine L-Histidine • HCl • H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine • HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine • 2Na • 2H2O L-Valine ADD Vitamins Choline Chloride Folic Acid myo-Inositol Niacinamide D-Pantothenic Acid • ˝Ca Pyridoxine • HCl Riboflavin Thiamine • HCl Other D-Glucose HEPES Phenol Red • Na Pyruvic Acid • Na pH 4,0 7,4 9,0

Sejttenyésztő edény Feloszthatók Típus/forma Felület nagysága Felület formája Felület minősége Felhasználási terület szerint

Sejttenyésztő edény Petri-csésze Sokféle átmérővel, falmagassággal és felszínnel gyártják, de nem mind alkalmas sejttenyésztésre!!! Előnyök: egyszerű, olcsó, jó gázcsere, a sejtek jól kinyerhetőek belőle. Hátrányok: könnyebben befertőződik, óvatosan kell manipulálni.

Sejttenyésztő edény Flaska Sokféle felszínnel gyártják, a műanyag kémiai kezelése és bevonata is különbözhet. Lehet szűrős vagy zárt kupakkal. Előnyök: könnyebb sterilen tartani, manipulálni. Hátrányok: nehezebb a sejtekhez való hozzáférés, rosszabb gázcsere, drága

Sejttenyésztő edény Sejttenyésztő lemez (plate) Sokféle geometria, lyukszám, felület és bevonat, nem mind alkalmas sejttenyésztésre!!! Előnyök: Standard külső méretek miatt automatizált kezelés és analízis, egyszerű kezelhetőség, sokféle igényhez található megfelelő lemez Hátrányok: szisztematikus hiba lehetősége (széli hatás) ELISA reader, multichannel pipetták, robotok

Sejttenyésztő edény Speciális tenyésztőedények Sejthozam növelés

Analitikai fejlesztés Sejttenyésztő edény Analitikai fejlesztés Speciális tenyésztőedények

Analitikai fejlesztés Sejttenyésztő edény Analitikai fejlesztés Speciális tenyésztőedények e-plate Transwell plate

Sejttenyésztő edény A felszín fontossága Kémiai kezelés Felszín Sejt adhézió Hidrofób Alacsony Nemionos hidrofil Nagyon alacsony Negatív hidrofil Ált. jó-nagyon jó Pozitív hidrofil Változó Speciális Sejtfüggő Biológiai bevonat Zselatin Endotél Poli-D-Lys Simaizom Matrigel 3D tenyészet Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells – 4 fokon folyik, 37-en megszilárdul

Kontrollált körülmények – termosztát Humán (ill. emlős, madár) sejtek esetén szabályozandó környezeti faktorok: Hőmérséklet (humán 37˚C, egér 38˚C, madarak 41-43˚C) Páratartalom 100% CO2 koncentráció általában 5% pH enyhén lúgos (7,2-7,4) A többi környezeti faktor stabilitását nem a termosztát, hanem a sejttenyésztő médium, ill. annak megfelelő cseréje biztosítja!

Hosszú távú tárolás (fagyasztás) Folyékony nitrogén vagy nitrogénnel hűtött tároló cél: víz üvegesedési hőmérsékleténél alacsonyabb hőmérséklet DMSO, glicerin – megakadályozzák az intracelluláris jégkristály képződést 1-2h tárolás -70˚C-on, majd áthelyezés a végleges tárolóba kontrollált hűtés: 1˚C/min (speciális fagyasztó) olvasztás gyorsan, csak 4-10˚C-ig, mert a krioprotektív adalékok mérgezők

Analitika

Analitika

Előnyök - hátrányok Előnyök Jól standardizálható Nagy áteresztőképesség (sok minta kísérletenként) Statisztikai biztonság (sok párhuzamos kísérletenként) Kísérleti körülmények rugalmas megválasztása Nagy módszertani repertoár Egyszerűbb, lecsupaszított modellek (kevesebb változóval kell számolni) Más módszerekkel nem megválaszolható kérdések tisztázása Hátrányok Az in vivo szituációktól erősen el tud térni! Statikus (bár áramlási is egyre népszerűbb) Kevés sejt-sejt kapcsolat Nincs idegrendszeri szabályozás Nincs immunrendszer (ezért antibiotikumok alkalmazása általános) Hipoproteinémiás közeg Nagy kezdeti beruházást igényel

Köszönöm a figyelmet!