Klinikai genomika 2013.

A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer szálak hibridizációja) DNS-DNS, DNS-RNS, RNS-RNS kapcsolat

Restrikciós enzimek tompa vég ragadós vég Restrikciós enzimek lehetővé teszik a DNS feldarabolását

RFLP The DNA probe in this experiment allows the scientist to visualize only the desired DNA bands without interference from all of the other DNA fragments generated by cutting all 46 chromosomes with HindIII.

SNP-RFLP;Southern blot Single nucleotid polymorphism (SNP) egy bázisnyi polimorfizmus

A témában a genetikai, majd genomikai kutatások száma 1990 után ugrott meg. PCR készülék Kary Mullis Nobel díj 1993 PCR, 1986

Real time-PCR Valós idejű PCR- amplifikáció előrehaladtával arányosan erősödő fluoreszcencia – kvantitatív meghatározást tesz lehetővé

PCR-RFLP A vizsgált DNS szakaszt PCR-rel felamplifikáljuk A keletkezett terméket hasítjuk restrikciós enzimekkel RFLP patterns of five DNA samples after digestion of the PCR-amplified products by KpnI and AluI enzymes. Lanes 1–5 are samples with genotype OO, BO, AO, AO and BO, respectively. Their types are determined according to the restriction patterns observed, as explained in Figure 2b. (b) ABO genotype is assigned by intersection of possible genotypes from patterns of DNA fragments by KpnI and AluI digestion (upper table). ABO genotypes can be determined for the five DNA samples. ABO alleles can be determined by amplifying the ABO glycosyl transferase locus. Exons 6 and 7 are amplified by PCR with two pairs of primers. Ota, Nature Protocols 2857-2864 (2007) Állapítsa meg az 1-5 személyek vércsoportját!

VNTR-marker VNTR-variable-number tandem repeats, kódoló, vagy nem-kódoló régióban is lehet A DNS mindenkiben előforduló két fix poziciója között egyedenként eltérő számú bázispár található VNTR-ek egyedi mintázatot mutatnak-DNS fingerprint VNTR lehet miniszatellit- 10-60bp, mikroszatellit- 1-4bp, mikroszatellit a STR-short tandem repeat, és az SSR-single sequence repeat Ábra: D2-előző házasság, S2-adoptált www.scq.ubc.ca VNTR-RFLP

VNTR vizsgálat Kvantitatív fluoreszcens multiplex PCR A vizsgálat az STR/VNTR lókuszok hosszúságpolimorfizmusán alapszik Multiplex PCR-rel vizsgálják A PCR termékeket kapilláris elektroforézissel választják el. In the case of an STR test, the analyst chooses specific DNA primers that allow the amplification of the tetranucleotide repeat DNA plus some of the sequence flanking it on either side. Because the sequence flanking the repeat does not vary from one person to another, the size of the PCR DNA product will directly reflect the number of repetitions of the repeated sequence that exist at that particular locus

Kapilláris (gél)elektroforézis A kapilláris gélelektroforézis a hagyományos gél-lap elektroforézis kapilláris elektroforézis megfelelője. Főbb előnye, hogy sokféle gél-mátrix használható – más az elválasztás (RNS, DNS, protein) 18S RNS 28S RNS 18S RNS 28S RNS Hibás futás oka lehet a minta bomlása, kisebb méret, hamarabb lefut. létra Hibás futás

VNTR klinikai felhasználás Triplet repeat diseases (TRD) olyan betegségek, ahol a mutáns génben 3 bázisból álló DNS tripletek (pl. CCG) tandem ismétlődnek akár több százszor (pl. CCG CCG CCG CCG CCG). A vad típusú allél csak néhány triplet ismétlődést tartalmaz, míg a TRD mutánsban a repeat-ek száma felsokszorozódik és az így kialakuló mutáns gén nagy számú tandem triplet repeat-et tartalmaz pl. Huntington kór, < 28 normál tartomány; páciensben nem fejlődik ki a kór 29-34 páciensben nem fejlődik ki kór, de a következő generáció veszélyeztetett 35-39 néhány egyénben kifejlődik a betegség, de nem mindenkiben, a következő generáció is veszélyeztetett > 40 kifejlődik a Huntington kór További TRD betegségek: FragilisX (FMR1), spinobulbar muscular atrophy, Friedreich’s ataxia, spinocerebellar ataxia Ez is VNTR/STR/mikrosatelita

Igazságügyi teszt DNS profil= az összes vizsgált kromoszóma marker genotípusa az adott egyedben Törvényszéki tesztek ált. 11-13 kromoszóma markert vizsgálnak Nem meghatározás: amelogenin polimorfizmus- amelogenin gén mind az X, mind az Y kromoszómán megtalálható, de az Y kromoszóma tartalmaz 6 olyan bázispárt, amit az X nem, ez alapján meghatározható a nem Combined DNA Index System (CODIS) is a DNA database funded by the United States Federal Bureau of Investigation (FBI)

Prenatális diagnosztika; fekete: 21 (és nemi); zöld: 13; kék: 18-as kromoszóma; ha 2 marker látszik minegyikből: nincsenek ilyen kromoszóma rendellenességei (99%) Méret marker (piros) 2 marker a nemi kromoszómákra: fiú

3 db 21-es marker: 21-es triszómia Egy nemi marker: lány

Triploidia 18 13 21

A hólyagtumorok korai kimutatása FDA Cleared

Hólyagtumorok jelentősége USA: 57.000 új beteg (2003), 10.000 halál Kb. 600.000 beteg/USA 400.000 betegnek van magas kockázata, hogy a betegség kiújuljon. Magyarország: 3-szor annyi férfi hal meg, mint nő Európában a rosszindulatú tumorok között az ötödik, USA-ban a negyedik leggyakoribb. Gyakorisága növekszik: becslések szerint 2010-re 28%-kal lesz magasabb az előfordulása

1250 resectio után a recidiva aránya: 1 éven belül 23,8% Kondas J, Szentgyorgyi E. Transurethral resection of 1250 bladder tumours Int Urol Nephrol. 1992;24(1):35-42. Magyarország: 1250 resectio után a recidiva aránya: 1 éven belül 23,8% 3 éven belül 36,6% 5 éves túlélési idő 66,5%

A hólyagrák diagnosztikájában jelenleg elterjedt és elérhető eszközök: Cystoscopia 0-2 évig: 3 havonta 2-4 évig: 6 havonta 5 év felett: évente Cytologia a cystoscopiákkal egyidőben

A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH) alapjai Rövid DNS szakaszt (oligonukleotidot) fluorescens festékkel jelölnek. Ez az oligonukleotid komplementer a minta (a vizsgált) DNS (kromoszóma) egy szakaszához

Hibridizálás A denaturált (egyszállúsított) mintával összehozva a jelölt oligonukleotid felismeri a komplementer szakaszt és odaköt (hibridizál).

A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH)

Előkészítés >33 ml 73ºC

UroVysion próbák  LSI 9p21 Spectrum Gold  CEP 3 Spectrum Red  CEP 7 Spectrum Green  CEP 17 Spectrum Aqua 3-askromoszóma 7-es kromoszóma 9-es kromoszóma 17-es kromoszóma 93 hólyagrákos és 86 normál betegen ellenőrizték a módszert

Normális és abnormális sejtmag összehasonlítása az optimalizált próbaszettel

UroVysion: Példák a lehetséges eltérésekre Normál Aneuploid Aneuploid

Szekvenálás

Szekvenálás sebessége 1990-2003: 1. humán genom 2007: 2 hónap/1 humán genom: Roche (454 Life Sciences); 2010: 7 nap Illumina; 2013: 1 nap;

2008 január: 2007 év módszere: szekvenálás

Humán genom szekvenálásának ára Hagyományos (Sanger) módszer HGP összköltsége: 3 milliárd $ 2001-ben átlagosan 10$/bázis: 2003: 300 millió $/ humán genom Új generációs szekvenálás: 2010: 7 nap Illumina; 10 ezer $ 2013: 1,000 $ Complete Genomics

Ion Proton: 149,000 $

NGS Exom-szekvenálás Célzott szekvenálás Bioinformatika

Microarray technológia Nukleotid láncok hibridizálásán alapuló nagy felbontású technológia Nukleotid próbákat kötnek szilárd hordozóra, ami lehet üveglapka-chip, illetve gyöngy Jelölt mintát hibridizálnak a próbákhoz Jel intenzitást mérnek

Comparative genome hybridization = CGH ArrayCGH = aCGH- genomiális DNS összehasonlítása microarray hibridizációval Hátrány: VOUS- variants of uncertain clinical significance Kiegyensúlyozott transzlokációk és alacsony szintű mozaicizmus nem vizsgálható

aCGH

aCGH klinikai felhasználása Betegség fókuszált array-k Hematológiai, onkológiai array-k Prenatális array-k Preimplantációs array-k ISCA-International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium. The ISCA provided an evidence-based summary of clinical cytogenetic testing comparing CMA to G-banded karyotyping with respect to technical advantages and limitations, diagnostic yield for various types of chromosomal aberrations, and issues that affect test interpretation. BAC-bacterial arteficial chromosome

Már megszületett az első újszülött, akinek anyja korábban habituális vetélő volt, de a aCGH-val sikerült kiválasztani IVF-nél a megfelelő ivarsejteket. aCGH a fejlődési rendellenességek 12%-át tudta kimutatni, a hagyományos kariotipizálás 2%-át. 200$ többletköltség/beteg. VRONY= veleszületett Rendellenességek Országos nyílvántartása

Expressziós microarray mRNS expressziós szintek összehasonlítására alkalmas a vizsgált mintákban/csoportokban Komplex bioinformatikai elemzés jellemző (GSEA-gene set enrichment analízis, Pathway analízis) Felhasználás pl.mikrobiológia-gazda patogén kölcsönhatás vizsgálata, gyógyszerfejlesztés, gyógyszer hatásvizsgálat, biomarker keresés (tumor diagnosztika)

Fiktív eset: Fragilis-X-szindróma Egy 6 éves fiú ismeretlen eredetű középsúlyos értelmi fogyatékosság miatt került a gyermek-neurológiai szakrendelésre. Egyéb tünete nem volt, azonban arca jellegzetes: hosszúkás arc előreugró (erőteljes) állkapocs nagy, elálló fülek. További tünetek lehetnének: macrorrhismus pubertás után, hyperextendabilis izületek, időnként autisztikus viselkedéselemek. Fénykép: http://www.ildongmom.com/servlet/service.FCntDselService?url=EmbryoSub2menu5 44 Erdélyi D 44

A FRAXA gén (17 exont tartalmaz) CGG-ismétlődés DNS mRNS CpG-szigetek 5’-UTR kódoló szekvencia 3’-UTR CGG-ismétlődés: 5-44 (54): normális - egészséges, stabil 45-54: szürke zóna - egészséges, instabil 55-230: premutáció - egészséges(*), utódja beteg lehet 230-1000: teljes mutáció - beteg vagy hordozó nő A géntermék egy RNS-kötő fehérje, melynek funkciója transzkripció-szabályzással, mRNS-transzporttal és -metabolizmussal kapcsolatos, egészen pontosan nem ismert. Patomechanizmus: nagyszámú repeat esetén metiálálódnak a CpG-szigetek, és gátolják a gén expresszióját. 45 Erdélyi D 45

A fragilis-X-szindróma diagnosztikája Citogenetikai vizsgálat: folsav-hiányos tenyésztőfolyadék alkalmazásával megjelenő „töréspont” (ma már nem használják) PCR alapú vizsgálat (csak szűrővizsgálatként) Southern-blot alapú vizsgálat (jelenleg ezt tartjuk legalkalmasabbnak) 46 Erdélyi D

Citogenetikai vizsgálat p q q27.3 Hátránya: nagyon munkaigényes, soká ad eredményt sok az álnegatív és álpozitív lelet Valójában nincs törés, csak befűződés. Forrás: www.mun.ca/biology/scarr/ Fragile_X_chromosome.htm 47 Erdélyi D 47

PCR- diagnosztika Egészséges férfi Egészséges nő 1 2 3 4 5 6 7 8 M PCR- diagnosztika 89 78 Egészséges férfi Egészséges nő Egészséges nő (homozigóta) Szürke zóna, nő Full-mutációs férfi Full-mutációs nő Premutációs nő Premutációs férfi 50 A CG-gazdag szekvenciák amplifikálása nehéz, ezért nem jelenik meg sáv, ha nagyon hosszú a CGG-ismétlődés. Full-mutációt hordozó nő PCR-képe megegyezik a homozigóta normáliséval. 35 32 30 28 22 20 26 48 1 2 3 4 5 6 7 8 M Erdélyi D 48

Southern-blot vizsgálat izotóppal jelzett próba Exon 1 EcoR I Eag I (metiláció-érzékeny: csak nem metilált szekvenciát hasít) EcoR I metiláció történik (a.) normálisan nőkben az egyik X-kromoszóma inaktivációjakor, vagy (b.) kóros esetben nagyon nagyszámú CGG-ismétlődés miatt 2,8 Kb 5,2 Kb 49 Erdélyi D

Forrás: http://www.compgene.com/fmr1.htm 1: Egészséges férfi: 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 2: Premutációs férfi: kissé hosszabb rövid Kb fragmentum. 3,4: Full-mutációs férfiak: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 5: Egészséges nő: 5,2 Kb metilált és 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 6: Premutációs nő: kissé hosszabb rövid és 5.2 Kb fragmentum. 7,8: Full-mutációs nők: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 50 Forrás: http://www.compgene.com/fmr1.htm Erdélyi D

Klinikai farmakogenomika

Jelentősége USA-ban évente legalább 100.000-n halnak meg évente a felírt gyógyszerek mellékhatásai miatt. Európában a kórházi beutalások 10%-a a gyógyszer mellékhatások miatt van. A vérnyomás kezelésére használt b-blokkolók az emberek 30%-ában, az antidepresszánsok a kezeltek 50%-ában hatástalan. Mindezekért 60-80%-ban az emberek közötti genetikai különbségek felelősek.

Becslések szerint a piacon levő gyógyszerek 20%-ának hatását befolyásolja a lebontó enzimjének polimorfizmusa. Gyors metabolizmus: a gyógyszer túl gyorsan kiürül, nem éri el a hatásos szintet Lassú metabolizmus: a gyógyszer felhalmozódhat, fokozott mellékhatások

Jelenleg: 118 gyógyszer-kísérőben van genetikai infó FDA honlap: http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm. Jelenleg: 118 gyógyszer-kísérőben van genetikai infó A legtöbb itt található tétel az onkológiai (32 darab) és pszichiátriai (30 darab) betegségeket érinti. Összesen 60-szor valamilyen CYP gén variációi szerepelnek. CYP2D6 39-szer, a CYP2C19, 16-szor fordul elő.

Egy retrospektív felmérésben, amelyben 53 ezer beteget, és 99 az FDA javaslatára farmakogenetikai információval ellátott gyógyszert vizsgáltak, kimutatták, hogy 300-600 súlyos mellékhatás lett volna elkerülhető, ha a javasolt farmakogenetikai tesztet elvégzik, és az eredménynek megfelelően járnak el.

Példák Succinylcholin: izomrelaxáns, kolinészteráz bontja le. 1/2500 emberben a butirilkolinészteráz (pszeudokolinészteráz) mindkét génje mutált: nem tudják lebontani a succinylcholint: hosszú izombénulás, apnoe (átmeneti légzésmegállás). Mercaptopurine: leukémiás, rákos gyermekek kezelése. Néhányan életveszélyes csontvelőkárosodást kaptak. Lebontóenzimje: tiopurin metiltranszferáz. 3 SNP-t találtak. Bármelyik is van, lassabb lebontás.

Leggyakoribb gyógyszer metabolizáló család Citokróm P450 (CYP) géncsalád. Májban termelődnek, és oxidálják az idegen kémiai anyagokat. 57 gén tartozik ide. Különösen jelentős: CYP2C19, CYP2D6, CYP2C9, CYP3A4, CYP3A5 Becslések szerint a súlyos gyógyszermellékhatások 80%-áért felelősek

Példák Kodein: fájdalom és köhögéscsillapító. A CYP2D6 alakítja át hatékony morfinná. Az emberek 10%-ában van egy polimorfizmus, ami miatt nem alakul át, így hatástalan.

Warfarin Véralvadásgátló. A terápia elkezdése a legnagyobb arányú mellékhatással, és sürgősségi ellátással társul. Az USA-ban évente több mint 2 millióan kezdenek warfarin terápiába, közülük 20 % az első 6 hónapon belül kórházi ellátást igényel. A farmakogenomikai teszt bevezetésével ez 30%-kal csökkenthető. Célpont: VKOR (vitamin K 2,3-epoxide reductase), amelyet gátol. Lebontás: CYP2C9: lassan bontó variánsok

Warfarin A VKORC1 (–1639G>A) polimorfizmusra heterozigóták 25%-kal, az AA homozigóták 50%-kal kevesebb warfarint igényelnek. Az egyének közötti dózis különbségek 12%-áért a CYP2C9, 25%-áért a VKOR gén polimorfizmusai a felelősek. Az FDA a két gén variációinak célzott tesztelését warfarin farmakogenetikai tesztként engedélyezte.

Személyi genomika. Pénzért (99$) mindenki számára hozzáférhető. With the new funding (50 million), 23andMe has one goal: reach a million customers by the end of 2013. To help speed things up, the company slashed the price of a test from $299 to $99. The price of genetics testing is falling, but not that fast. The company hasn't disclosed its costs, but people working in the field say that it’s safe to say that 23andMe is heavily subsidizing the test. Competitor deCODEme charges $1,100 for a similar service. That means 23andMe is losing money, potentially a ton of money, in order to reach a critical mass of data.

Köszönöm a figyelmet!