BAKTÉRIUMOK TENYÉSZTÉSE

A növekedést befolyásoló tényezők Tápanyagok Szénforrás (CH, AS szénlánca), nitrogénforrás (pepton, ammónia) !! növekedési faktorok, vitaminok, nyomelemek Hőmérséklet pszichrofil (<20°C)– mezofil – termofil (>50 Thermus aquaticus) pH acidofil (Lactobacillus) – alkalofil (Vibrio cholerae), legtöbb 7,2-7,6

Oxigénigény Obligát aerob (csak O2 jelenlétében M. tuberculosis) / fakultatív anaerob / obligát anaerob (Clostridiumok, toxikus az O2,) CO2 atmoszféra mértéke légköri = 0.03% Mikroaerofil (alacsony O2, magas CO2, C. jejuni ), aerotoleráns (02 jelenlétében is fermentál S.pyogenes) Toxikus oxigénformák közömbösítésének képessége: Szuperoxid diszmutáz (2 O2- + 2 H+  H2O2 + O2) Kataláz (2 H2O2  2 H2O + O2)

Táplálkozási típusok - I Autotróf szervetlenből szervest építenek fel ehhez energiaforrás: fény (fotoautotrófok) oxidáció (kemoautotrófok) pl. szulfid  szulfát, nitrit  nitrát kórtani jelentőségük nincs

Táplálkozási típusok - II Heterotróf szerves tápanyagot igényelnek C-forrás: glükóz, tejsav, keményítő, … N-forrás: aminosavak, … majdnem az összes patogén ide tartozik Paratróf csak élő sejtekben tudnak szaporodni pl. lepra kórokozója (egértalpban), rickettsiák

Energianyerés típusai Légzés (aerobok!) van kataláz és szuperoxid-diszmutáz enzim szénhidrát anyagcsere: glükóz  piroszőlősav  citrátkör  légzési lánc  sok ATP + CO2 + H2O terminális elektron-akceptor = O2 Fermentáció (anaerobok!) nincs enzim a káros oxidációs termékek semlegesítésére glükóz  etanol + tejsav  kevés ATP + CO2 + H2

Baktériumok növekedési görbéje Idő Log sejtszám IV III II I Generációs idő 20/40 perc de M. tuberculosis 20h !! I. Lag fázis (adaptáció) II. Log fázis (exponenciális növekedés) III. Stacioner fázis (élő sejtszám változatlan) IV. Deklinációs fázis (hanyatlás, fogyás)

Táptalajok - I STERILITÁS !!! Halmazállapot szerint Előállítás szerint folyékony (húslé, buillon) szilárd (lemez, magas, ferde agar, Koch találta ki) Petri csésze! Előállítás szerint természetes (epe, tej, húslé, ...) mesterséges Funkció szerint „normál” szelektív (pl antibiotikummal gátlódik ami nem érdekel minket) differenciáló ( biokém tul alapján elkülöníthetőek a hasonló baktériumok) dúsító STERILITÁS !!!

Táptalajok - II Bouillon Ferde és magas agar Dúsítók: húsos és szérum bouillon

Táptalajok - III Egyszerű lemez agar Véres agar Csokoládé agar

Telepmorfológiai jellemzők telep nagysága telep fénye (tükröződő, opál, áttetsző) telep alak (ép szélű, csipkézett, köldökös , kerek, platószerű) telep állaga (sima, száraz, gumiszerű, elfolyós) telep színe (pigment termelés) hemolízis:  és  tenyészet szaga (hársfa, fokhagyma)

Telepmorfológiai jellemzők Hogy ezeket lássuk, IZOLÁLT TELEPEK-re van szükségünk:

Mintatenyészetek - I Escherichia coli agar táptalajon semmi különös jellemző, átlagos telepek Klebsiella agar táptalajon nagy poliszaccharid tok  nyálkás telepek

Mintatenyészetek - II Bacillus cereus agar táptalajon erősen nyálkás, csipkézett szélű, felhő-szerű („medúzafő-szerű”) tenyészet, ritka az izolált telep

Mintatenyészetek - III Proteus mirabilis agar táptalajon rajzás !

Mintatenyészetek - IV Intracelluláris pigmenttermelés Staphylococcus aureus arany pigment Staphylococcus epidermidis fehér pigment Serratia marcescens vérvörös pigment

Mintatenyészetek - V Extracelluláris pigmenttermelés Pseudomonas auruginosa többféle pigment, extracellulárisan  az egész táptalaj elszíneződik a zöld pigment dominál táptalajon

Mintatenyészetek - VI - hemolízis Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus teljes feltisztulás Csak véres agaron Véres agaron Csokoládé agaron  -hemolízis: Streptococcus pneumoniae, zöldítő streptococcusok zöld terület a telepek körül

Anaerob tenyésztés I - Fizikai módszerek O2 kiforralása O2 kiszívása (vákuum – anaerosztát) Szúrt tenyészet magas agaron (karácsonyfa)

Anaerob tenyésztés II - Kémiai módszerek 1. Redoxpotenciál csökkentése Holman médium (apróra darált húsdarabkák) tioglikolátos médium indikátor jelzi az átlevegősödést lezárás paraffin gyűrűvel

Anaerob tenyésztés II - Kémiai módszerek 2. Preis módszer erősen O2-igényes reakció játszódik le a tenyésztési térben GasPak: a tenyészetek behelyezése után a felszakított zacskókban levő reagensek reagálni tudnak egymással, elvonva az oxigént (CO2 fejlesztés)

Anaerob tenyésztés III - Biológiai módszer Fortner eljárás elavult!! A két részre osztott Petri csésze egyik térfelén erősen aerob baktériumot (pl. Serratia) tenyésztünk, ami elvonja az összes oxigént

Hemokultúra - I Vér vagy más steril minta tenyésztésére Milyen esetben alkalmazzuk: meningitis, endocarditis, bacteraemia, szisztémás fertőzés gyanúja, peritonitis, FUO (=ismeretlen eredetű láz), mesterséges lélegeztetés során kialakuló fertőzés, kórokozó váltás terápia alatt, implantáció utáni láz, … Inkubációs idő: 7-10 nap de: 80-90%-ban már az első 24 óra alatt pozitív lesz!

Hemokultúra - II Fontos szabályok Sterilitás!! Legalább két minta kell: kül. helyekről, kül. időben ! Frissen szúrt vénából !! legjobb a láz kezdetén elegendő mennyiséget kell levenni (2-30 ml) Sterilitás!! Antibiotikum kezelés alatt: ab-kötő gyöngyökkel Aerob / anaerob palackpár

Hemokultúra - III

Transzport médiumok - I Transzport közeg példa: Stuart médium a baktériumok maximum 48 óráig túlélnek, de nem szaporodnak 0,2%-os agar Tárolás szobahőn! anaerobok is túlélnek

Transzport médiumok - II Transzport táptalajok A baktériumok szaporodnak is benne, mire a laborba érnek Példák: Uriline, Uricult, Gonoline, stb. Műanyag lemez két oldalán két vagy három különböző táptalaj (szelektívek is)

Biofilm - I Jelentősége Kialakulása vízben élő mikroorganizmusok 99,9%-a biofilmként él a felszíneken élő szervezetben: felületek kolonizációja (natív és beültetett) Kialakulása előkészítő réteg (slime képzés): elektrolitok (Ca2+, Mg2+), fehérjék, stb. baktériumok letapadása, konzorcium létrehozása biofilm leszakadása (disszemináció) planktonikus

Biofilm - II Kimutatása Antibiotikum rezisztencia nagyobb elektronmikroszkóppal üvegcső falán, festéssel Antibiotikum rezisztencia nagyobb penetráció gátolt szaporodás lassúbb géntranszfer sokkal intenzívebb (+leszakadáskor elviszik!)

Antibiotikum rezisztencia: biofilm versus planktonikus fázis Baktérium Antibiotikum MIC [mg/L] a planktonikus fázisban MIC [mg/L] a biofilmben Staph. aureus vancomycin 2 20 Pseudomonas aeruginosa imipenem 1 1024 E. coli ampicillin 512 P. pseudomallei ceftazidim 8 800 Str. sanguis doxycyclin 0.063 3.15 Donlan, Clin Microbiol Rev. 2002; 15(2): 167–193.

Biofilm - III Kórképek biofilmmel: natív szívbillentyű endocarditis (Streptococcus, S. aureus, Enterococcus , Candida, Aspergillus) beültetett eszközök: érpálya kanülök (pl. centrális vénás, perifériás), húgyúti katéterek (Enterococcus, Gram -, Pseudomonas, Serratia, Citrobacter), műbillentyű, intrauterin eszközök, fogászati implantátumok (titánium), kontakt lencse, beültetett szemlencse, csípőprotézis, térdprotézis, … krónikus bakteriális prostatitis CF (cisztikus fibrózis): Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Burkholderia, H. influenzae (alginát képzés!) periodontitis, fog plaque