Génkifejeződés regulációja

differenciáció Neuron & limfocita (ellenanyag termelés) Vörös vértestek (haemoglobin termelés) Hasnyálmirigy B sejtek: insulin A sejtek: glukagon ezekben a sejtekben ugyanazok a gének találhatóak, a különbségek pedig a génexpresszióra vezethetők vissza. differenciáció

A multicelluláris organizmusok sejtjei azonos DNS-t (genomot) tartalmaznak birka, szarvasmarha, disznó, kecske, egér

Különféle sejtek eltérő expressziós mintázatot mutatnak. each type of tumor has a characteristic gene expression pattern DNA microarray Differences in mRNA expression patterns among different types of human cancer cells. The mRNA levels of 1800 selected genes (arranged top to bottom) were determined for 142 different human tumors (arranged left to right), each from a different patient. Each small red bar indicates that the given gene in the given tumor is transcribed at a level significantly higher than the average across all the cell lines. Each small green bar indicates a less-than-average expression level, and each black bar denotes an expression level that is close to average across the different tumors.

Különféle sejtek eltérő expressziós mintázatot mutatnak. Fehérjék szintjén 2-D fehérje gél-elfo. the proteins have been separated by molecular weight (top to bottom) and isoelectric point, the pH at which the protein has no net charge (right to left). The protein spots artificially colored red are common to both samples; those in blue are specific to one of the two tissues. The differences between the two tissue samples vastly outweigh their similarities: even for proteins that are shared between the two tissues, their relative abundance is usually different. Note that this technique separates proteins both by size and charge; therefore a protein that has, for example, several different phosphorylation states will appear as a series of horizontal spots (see upper right-hand portion of right panel).

A sejtek képesek megváltoztatni expressziós mintázatukat külső ingerek hatására. ehezés/fizikai terhelés Glükokortikoidok máj sejtekben: tirozin-aminotranszferáz szintézise fokozódik tirozin glükóz zsír sejtekben: tirozin-aminotranszferáz alíg fejeződik ki

Az expresszió több szinten is regulálható.

Transzkripció regulációja 1960-as évek: a géneket ki/be lehet kapcsolni – paradigma, E. coli kísérletek Eukarióták: kromatin szerkezet promoter 5’ 3’ r r r RNS-pol IS ORF r - IS - transzkripciós iniciációshely RNS-pol RNS – polimeráz II. kötőhely (50bp-nyi szakasz) regulátor DNS – szekvenciák (10 bp -10 kb szakasz; több száz féle)

Transzkripció regulációja promoter 5’ 3’ r r r RNS-pol IS ORF r - IS - transzkripciós iniciációshely RNS-pol RNS – polimeráz II. kötőhely (50bp-nyi szakasz) regulátor DNS – szekvenciák (10 bp -10 kb szakasz; több száz féle) A gén - szabályzó fehérjék hozzákapcsolódnak a regulátor DNS szekvenicákhoz különféle g-r fehérjék különféle DNS-szekvenciákat ismernek fel; g-r fehérjék a DNS nagy árkában helyezkednek el; g-r fehérjék molekuláris kölcsönhatásokat (hidrogén-, ionos-kötések, hidrofób interakciók) létesítenek nukleotidák bázisaival; habár az egyedi molekuláris kölcsönhatások gyengék, általában 20 DNS – fehérje közti interakció stabilizálja és specifikussá teszi a kölcsönhatást; ezek a kölcsönhatások nem eredményezik a komplementer DNS-szálak közti H-hídak felbomlását;

DNS-kötő doménjeik révén a gén - szabályó fehérjék hozzákapcsolódnak a regulátor DNS szekvenicákhoz

Aktivátorok és represszorok Baktériumok : - genom 4,6 x106 bp / 4300 gén; - génexpresszió és tápanyag források Triptofán operon triptofán represszor The clustered genes in E. coli that code for enzymes that manufacture the amino acid tryptophan. These five genes are transcribed as a single mRNA molecule, a feature that allows their expression to be controlled coordinately.

Triptofán operon triptofán represszor The binding of tryptophan to the tryptophan repressor protein changes the conformation of the repressor. The conformational change enables this gene regulatory protein to bind tightly to a specific DNA sequence (the operator), thereby blocking transcription of the genes encoding the enzymes required to produce tryptophan (the trp operon). The three-dimensional structure of this bacterial helix-turn-helix protein, as determined by x-ray diffraction with and without tryptophan bound, is illustrated. Tryptophan binding increases the distance between the two recognition helices in the homodimer, allowing the repressor to fit snugly on the operator. (Adapted from R. Zhang et al., Nature 327:591–597, 1987.)

Aktivátorok promoter-közeli régiókhoz kötődnek és segítik az RNS-polimeráz II megkötését, majd a hatékony transzkripciót CAP CAP cAMP CAP cAMP A magas cAMP koncentráció jelzi a baktériumnak, hogy a glükóz koncentrációja alacsony a sejtben, és ennek következtében olyan gének lesznek bekapcsolva, amelyek más cukor molekulák degradációjában működnek közre.

A lac-operon működését a lac represszor és a CAP aktivátor szabályozza A lac-operon azokat az enzimeket kódolja, amelyek a laktóz diszaharid importjáért és elbontásáért felelősek. Glükóz mint preferált C-forrás

The mechanisms by which gene regulatory proteins control gene transcription in procaryotes. (A) Negative regulation; (B) positive regulation. Note that the addition of an “inducing” ligand can turn on a gene either by removing a gene repressor protein from the DNA (upper left panel) or by causing a gene activator protein to bind (lower right panel). Likewise, the addition of an “inhibitory” ligand can turn off a gene either by removing a gene activator protein from the DNA (upper right panel) or by causing a gene repressor protein to bind (lower left panel).

Az eukarióta transzkripció szabályozása összetett. 4 alapvető különbség van a prokariota és eukariota transzkripciós reguláció között: Prokariotákban egy RNS-polimeráz van, míg az eukariotákban három, RNS-polimeráz I: rRNS gének; RNS-polimeráz II: fehérje-kódoló gének és kis RNS gének (spliceosome-ban lévők); RNS-polimeráz III: t-RNS gének, 5S rRNS gének, kis RNS gének A bakteriális RNS-polimeráz önmagában képes a transzkripció iniciációjára, azonban az eukarioták esetében az RNS-polimerázoknak szükségük van un. általános transzkripciós faktorokra. A baktériumokban az aktivátor és represszor molekulák kizárólag a promoter-közeli elemekhez kötődnek. Az eukariotákban a promoter-közeli elemeken kívül számos és igencsak távoli szabályzó szekvencia létezik, amelyekhez ezek hozzá kötődhetnek, végtelen számú regulációs mechanizmust eredményeznek. Az eukariota transzkripció iniciációja során ki kell csomagolni a kromatin szerkezetet

Az eukarioták RNS-polimeráz II. általános transzkripciós faktorai TATA-box majdnem minden eukariota promoterben megtalálható. TBP TATA-box DNS lokális disztorziója Transzkripciós iniciációs komplex összeszerelése RNS-polimeráz II megkezdi a transzkripciót, néhány transzkriptet processzáló fehérjét magával visz. Transzkripciós iniciációs komplex disszociációja

Az eukariota transzkripció cisz szabályzása Az RNS polimeráz II a maximális transzkripció sebesség eléréséhez három cisz elemet, promotert, promoter-közeli és enhanszer - silencer elemeket igényli. Transzkripciós iniciációs komplex RNS polimeráz II kezdő-komplex GC-box CCAAT-box Promoter Promoter- közeli elemek regulátor DNS – szekvenciák (10 bp -10 kb szakasz; több száz féle)

A transzkripció transz szabályozása Transz-ható transzkripciós faktorok (TAF-ok). Sok ismert. Enhanszerekhez vagy a promoterhez kötődnek, segítik az RNS polimeráz II kezdő-komplex kialakulását. Az élesztő TAF-ok két tagja, a GCN4 és a GAL4 nevezetes. A GCN4 aminosav bioszintetikus utak génjeit aktiválja. Aminosav éhezéskor a GCN4 mennyisége megnő, ami fokozza a szabályzott gének transzkripcióját. GAL4 a galaktóz metabolizmus TAF-ja. Két doménből, DNS kötő és aktiváló doménből áll. Jól ismert, 17 nukleotid hosszú UAS-hez kötődik.

Enhancerek/silencerek up- és/vagy downstream is elhelyezkedhetnek. Az eukariota transzkripció iniciálásában távoli genomikus régiók (enhanszer és silencer) is szerepet játszanak aktivátor és represszor fehérjék révén. Enhancerek/silencerek up- és/vagy downstream is elhelyezkedhetnek. Kromatin kihurkolás révén az enhancer/silencerek gén-reguláló fehérjéi közvetlenül a promoter régióra fejtik ki hatásukat. Az enhancer/silencerek gén-reguláló fehérjéi kromatin fehérjék révén befolyásolhatják a kromatin szerkezetét, azaz a promoter regió hozzáférhetőségét az RNS-polimeráz II és az általános transzkripciós faktorok esetébén.

A promoter regió kromatin szerkezete befolyásolja a transzkripció iniciációját A nukleoszómák gátolják a transzkripciót, ha a promoter-régió közvetlenül felettük helyezkedik el.

A transzkripció szabályzó apparátusa.

Molekuláris mechanizmusok sejtsorsok kombinációs kontroll Sejtmemória: a differenciáció során a génexpressziós mintázat szigorúan szabályzott. kombinációs kontroll tranziens génexpresszió szabályozása ideiglenes jellegű

kombinációs kontroll day-to-day regulation of cell function ehezés/fizikai terhelés Glükokortikoidok máj sejtekben: tirozin-aminotranszferáz szintézise fokozódik tirozin glükóz zsír sejtekben: tirozin-aminotranszferáz alíg fejeződik ki day-to-day regulation of cell function Ugyanaz az aktivátor vagy represszor több gén transzkripcióját is szabályozhatja kombinációs kontroll A glükokortikoid receptor mint több gén transzkripciós szabályzó fehérjéje

kombinációs kontroll és sejtdifferenciáció Myo D Myoblasztok fúziója aktin, myozin, ion csatorna, receptor gének izomsejt Fibroblasztok Myo D

kombinációs kontroll és sejtdifferenciáció Különféle gén-reguláló fehérjék kombinációja többféle sejt típust eredményez

Egy adott sejt génexpressziós mintázata átörökíthető az útodsejtekre. differenciálódott sejtek Sima izomsejtek, fibroblasztok, hepatociták képesek osztódni és átörökíteni …. a positive feedback loop can create cell memory A fő transzkripciós regulátor fehérje saját génexpresszióját is szabályozza. Az expressziós mintázat atörökítése a kromatin szerkezete révén (X kromoszóma inaktivació)

A szervképződést egyetlen gén-reguláló fehérje kiválthatja. Ey mint gén-reguláló fehérje számos más gén expresszióját szabályozza, amelyek a szem kialakulásáért felelősek.

A transzkripcós apparátuson kívül néhány tényező jelentős hatással lehet a transzkripció eredményességére. 1. A kódoló DNS szakasz metilálása (5-metilcitozin) megakadályozza a transzkripciót. 2. Az mRNS stabilitása befolyásolja a géntermék mennyiségét. Például a poliA farok stabilizálja a mRNS-t. Rövid féléletidejű mRNS-ek 3’ végén jellegzetes sorrendek ismerhetők fel, pl. A(U)nA ismétlődések jelentősen csökkentik a fél-élettartamot.

Transzkripciós szabályozás: testszelvényezettség kialakulása testtáj koordináták és testszelvényezettség kialakulása The story of eve (even-skipped).

Examples of the phenotypes of mutations affecting the three types of segmentation genes. In each case the areas shaded in green on the normal larva (left) are deleted in the mutant or are replaced by mirror-image duplicates of the unaffected regions.

Anterior – posterior polaritás A petesejt citoplazmája nem homogén! The nonuniform distribution of four gene regulatory proteins in an early Drosophila embryo. At this stage the embryo is a syncytium, with multiple nuclei in a common cytoplasm. Although not illustrated in these drawings, all of these proteins are concentrated in the nuclei.

7 reguláló modul a promoter-közeli régióban Minden modul eltérő DNS szekvenciával rendelkezik és a négy GAP-fehérje koncentráció-gradíensének megfelelő kombinációja aktiválja egyedileg az eve gént a paraszegmentekben. Experiment demonstrating the modular construction of the eve gene regulatory region. (A) A 480-nucleotide-pair piece of the eve regulatory region was removed and inserted upstream of a test promoter that directs the synthesis of the enzyme β-galactosidase. (B) When this artificial construct was reintroduced into the genome of Drosophila embryos, the embryos expressed β-galactosidase (detectable by histochemical staining) precisely in the position of the second of the seven Eve stripes (C) The seven Eve stripes.

The nuclei are exposed directly to positional cues in the form of concentrations of gene regulatory proteins Distribution of the gene regulatory proteins responsible for ensuring that eve is expressed in stripe 2. The distributions of these proteins were visualized by staining a developing Drosophila embryo with antibodies directed against each of the four proteins The expression of eve in stripe 2 occurs only at the position where the two activators (Bicoid and Hunchback) are present and the two repressors (Giant and Krüppel) are absent. In fly embryos that lack Krüppel, for example, stripe 2 expands posteriorly. The eve gene itself encodes a gene regulatory protein, which, after its pattern of expression is set up in seven stripes, regulates the expression of other Drosophila genes. As development proceeds, the embryo is thus subdivided into finer and finer regions that eventually give rise to the different body parts of the adult fly.

Figure 7-55. Close-up view of the eve stripe 2 unit                                                                     Figure 7-55. Close-up view of the eve stripe 2 unit. The segment of the eve gene control region identified in the previous figure contains regulatory sequences, each of which binds one or another of four gene regulatory proteins. It is known from genetic experiments that these four regulatory proteins are responsible for the proper expression of eve in stripe 2. Flies that are deficient in the two gene activators Bicoid and Hunchback, for example, fail to efficiently express eve in stripe 2. In flies deficient in either of the two gene repressors, Giant and Krüppel, stripe 2 expands and covers an abnormally broad region of the embryo. The DNA-binding sites for these gene regulatory proteins were determined by cloning the genes encoding the proteins, overexpressing the proteins in E. coli, purifying them, and performing DNA-footprinting experiments as described in Chapter 8. The top diagram indicates that, in some cases, the binding sites for the gene regulatory proteins overlap and the proteins can compete for binding to the DNA. For example, binding of Krüppel and binding of Bicoid to the site at the far right are thought to be mutually exclusive.

                                Figure 7-53. The seven stripes of the protein encoded by the even-skipped (eve) gene in a developing Drosophila embryo. Two and one-half hours after fertilization, the egg was fixed and stained with antibodies that recognize the Eve protein (green) and antibodies that recognize the Giant protein (red). Where Eve and Giant proteins are both present, the staining appears yellow. At this stage in development, the egg contains approximately 4000 nuclei. The Eve and Giant proteins are both located in the nuclei, and the Eve stripes are about four nuclei wide. The staining pattern of the Giant protein is also shown in Figure 7-52. (Courtesy of Michael Levine.)