LIPIDPEROXIDÁCIÓ ÉS A BIOLÓGIAI ANTIOXIDÁNS VÉDELEM Life is a constant battle against becoming rancid... (P. Cloud, 1979)

Szabad gyökök: azok a kémiai gyökök, amelyek külső elektronhéjukon egy vagy több párnélküli elektront vagy antiparalell spinekkel rendelkező elektronokat tartalmazó atomot tartalmaznak. Oxigén szabad gyökök: azok a szabad gyökök, amelyekben a párnélküli elektron vagy elektronok egy oxigén atom külső orbitálján helyez- kedik el.

Szabadgyökök Szuperoxid (O2 -): enzimatikus, auto-oxidációs, nem-enzi- matikus elektron transzfer reakciók során keletkezik. Vizes oldata oxidálja az aszkorbinsavat, redukálja a cito- krom c és más kelát vas atomját. Hidroxil (OH) : rendkivül reaktiv gyök, amely minden bio- lógiai molekulát oxidál Peroxil, alkoxil (RO2, RO) : tipikus szerves oxigén sza- bad gyök, amely a lipid peroxidáció során (is) keletkezik, amikor a hidroperoxidokat az átmeneti fémek redukálják. A szén-tetrakloridból képzõdõ gyök is ebbe a csoportba tartozik (CCl3O2)

Alkil-peroxil (ROO): az alkoxil gyök által indukált lánc- reakció során keletkezik a lipid peroxidáció folyamata során. Nitrogén-oxidok (NO, NO2): a nitrogén-oxid in vivo az L-argininbõl keletkezik. A nitrogén-dioxid akkor keletkezik, amikor a NO oxigénnel reagál (pl. szmog, dohányfüst)

Hidrogén-peroxid (H2O2): in vivo a dizmutázok és számos Nem szabadgyökök Hidrogén-peroxid (H2O2): in vivo a dizmutázok és számos oxidáz hatására, valamint a hidroxil gyök és átmeneti fém jelenlétében is létrejöhet. Kis koncentrációban kevéssé reaktiv, de nagyobb mennyiségben károsítja a sejtek energia-felszabaditó rendszerét. Hipoklór-sav (HOCl): a mieloperoxidáz hatására a neutro- fil sejtek termelik gyulladásos folyamatok során. Szuper- oxid anionnal reagálva hidroxil gyök is létrejöhet a neutrofil aktiváció során. Ózon(O3): a légkörben keletkezik. Rendkivül reaktiv gáz. A vérplazma antioxidánsok közül oxidálja (bontja) a D- és E- vitamint és a húgysavat.

Szinglet oxigén (1O2): az oxigén külsõ két orbitálján lévõ egyik elektron inverz spinnel rendelkezik, emiatt megválto- zik a molekuláris oxigén kvantum-mechanikai stabilitása. A fotoszintézis során a membránokhoz kötött oxigén szállí- tás során keletkezik növényekben. Szerves peroxid (ROOH): a lipidek oxidációs terméke a lipidperoxidáció során, amely főképp szinglet oxigén hatására keletkezik

AZ OXIGÉN SZABADGYÖKÖK FORRÁSAI Mitokondriális és mikroszomális (kloroplasztisz) elektron transzport - oxigén tetravalens redukciója 1O2 O2H+ h    e-  e-, H+ e-, H+ e-,H+ 3O2  O2 -  H2O2  OH  H2O 2. Fagocitózis során a PMN leukocitákban H2O  H2O2 H2O + Cl-  HOCl + H+

3. Enzimrendszerek működése során: - NADP oxidáz - Xantin – oxidáz - Monoamin - oxidáz - Citokrom P450 – oxidáz 4. Hidroxil gyök (OH) keletkezésének egyéb útja: Fenton és Haber-Weiss reakciók révén (Fenton, 1894, Haber és Weiss, 1934): O2 + e-  (O2)- (O2)- + H2O2 + Mn  HO- + (OH) + O2 + Mn+1

4. Szuperoxid anion (O2- ) keletkezésének fő útja: citokróm rendszer (gyorsan átalakul hidrogén-peroxiddá a piridoxamin- foszfát-oxidáz, illetve a szuperoxid dizmutáz enzimek hatására) (O2)- + (O2)- + 2H+  H2O2 + O2

A SZABADGYÖKÖK HATÁSA AZ EGYES LÉTFONTOSSÁGÚ MOLEKULÁKRA DNS FEHÉRJÉK Enzimek inaktivációja Deoxi guanozin REAKTÍV OXIGÉN GYÖKÖK LIPOPROTEINEK TÖBBSZÖRÖSEN TELÍTETLEN ZSÍRSAVAK LDL oxidáció Lipid peroxidáció

A ROS SZÜKSÉGES: SEJTMŰKÖDÉS SZABÁLYOZÁSÁBAN SZIGNÁL TRANSZMISSZIÓS FOLYAMATOKHOZ SEJTOSZTÓDÁSHOZ GYULLADÁSOS FOLYAMATOKHOZ APOPTOZISHOZ

CASPASE-8 CASPASE- 3  Pro-caspase-3 MITOKONDRIUM D4-GDI APOPTÓTIKUS SZIGNÁLOK  ROS Szignál transzmisszió : death receptors (TNF superfamily) + DD (death domain) CASPASE-8 CASPASE- 3  Pro-caspase-3 MITOKONDRIUM D4-GDI (GDP dissociation inhibitor) CITOKROM C KIÁRAMLÁS CASPASE-9 AKTIVÁCIÓ SEJTMAG GTP-ÁZOK DNS FRAGMENTÁCIÓ MEMBRÁN (poli-(ADP)-ribóz szint ) CITOSZKELETON VÁLTOZÁSOK SOD kiáramlás SEJTHALÁL

A lipid peroxidáció mechanizmusa Lipid peroxidáció (oxidativ stressz): a biológiailag aktív molekulák reakciója oxigén eredetű molekulákkal és gyökökkel A lipid peroxidáció folyamatának fő szakaszai: (1) Iniciáció: szabadgyök képződés (2) Propagáció: a szabadgyök képződés láncreakciószerű kiteljesedése (3) Termináció: (kvázi)stabil gyökök és molekulák keletkezése

LIPID PEROXIDÁCIÓ – OXIDATÍV STRESSZ ÁTMENETI FÉMEK (VAS/RÉZ) HATÁSA LH (PUFA)  L L + O2-  LOOH ÁTMENETI FÉMEK (VAS/RÉZ) HATÁSA LOOH + Fe(II)  Fe(III) + OH- + LO LOOH + Fe(III)  Fe(II) + H+ + LOO

A C-18-as zsírsavak relatív oxidációs sebessége (Varst, 2001 nyomán)

A MEMBRÁNOK OXIDATÍV KÁROSODÁSA

NEM ENZIMATIKUS VÉDELEM ANTIOXIDÁNS VÉDELEM NEM ENZIMATIKUS VÉDELEM E-VITAMIN (  - tokoferol) Hatása: biológiai membránok védelme kromángyűrű – fizikai kapcsolat a foszfolipidekkel fitil oldallánc – keresztkötések az arachidonil oldallánccal OH gyök „akció radiusa” 10-9 sec = 2-3 nm

Egyes tokoferol és tokotrienol vegyületek oxidáció kinetikája azobis iniciátor jelenlétében

C-VITAMIN (L-aszkorbinsav) HATÁSA: hidrogén donor redukáló tulajdonságú – tokoferol „regeneráció” - GSSG redukciója TOC  TQ + AH  TOC + DHA GSSG + 2AH  2GSH + 2DHA A gazdasági állatok képesek a C-vitamin szintézisére DE szintézis kapacitás  aktuális igény

UBIQUINON (CoQ) Hatása: szelén / E-vitamin hiány esetén antioxidáns – elektron donor Máj (hepatociták) védelme KAROTINOIDOK (β-karotin) Hatása: peroxil gyökfogó vegyület máj, ovarium (c. luteum), here (Leydig sejtek) védelme A-VITAMIN - önmagában nem antioxidáns kémiai szerkezete alapján gyökfogó hatású máj, ovarium, here védelme

Fémkötő (kelátképző) vegyületek Ferritin (1 mol/ 45000 vas) – az állati szervezetben Idegsejtek és máj védelme Metallothionein: Hg< Cu< Cd < Zn máj védelme (vesében felszabadul a fémion) Egyéb antioxidáns vegyületek Glutation - -Glu-Cys-Gly Hatásai: fehérjék SH csoportjainak fenntartása cisztein raktár xenobiotikum konjugáció ( R + GSH  GS-R + H) minden sejttípus védelme

ENZIMATIKUS VÉDELEM Szuperoxid-dizmutáz Cu-Zn – citoszol Mn – mitokondrium Fe – prokarioták O2 + O2 + 2H+  H2O2 + O2 minden sejttípus védelme (mitokondrium + citoszol) Aktivitását befolyásoló tényezők: oxidatív stressz esetén emelkedik mikroelem hiány (Cu, Zn, Mn)

Kataláz Fe tartalmú 2H2O2  O2 + 2H2O vörösvérsejtek, fehérvérsejtek védelme Aktivitását befolyásoló tényezők: életkor (génexpressziója az öregedéssel csökken) takarmány megvonás (csökkenti az öregedés hatását)

Glutation-peroxidázok (aktív centruma SECIS element – szelenocisztein (TGA – UGA kodon) - Se tartalmú 2GSH + H2O2  GSSG + 2H2O Klasszikus glutation-peroxidáz (Mills, 1957) –H2O2 (VVS) Citoszol glutation-peroxidáz (Rotruck et al, 1973) - H2O2 + lipidperoxidok + koleszterol-7-;7-hidroperoxidok máj-, harántcsíkolt izmok, érfal endothel sejtek, idegsejtek Foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz (Ursini,1985) – foszfolipid-hidroperoxidok - monomer membrán kötött enzim (madarak májában citoszol forma is) Minden sejt, spermium nukleusz GSH-Px (S-H S-S)

A "stem-loop" másodlagos mRNS 3' UTR szerkezet felépítésének általános sémája [Low és Berry, 1996] a.) a klasszikus glutation-peroxidáz mRNS-ében, b.) a foszfolipid és az extracelluláris glutation-peroxidáz mRNS-ében

A szelenocisztein beépülésének sémája eukariotákban (Berry et al., 1993)

Extracelluláris glutation-peroxidáz (Takahashi,1990) -H2O2 vérplazmában és szövetekben (extracelluláris térben) Vérplazma glutation-peroxidáz (Avissar et.al., 1994) - H2O2 vérplazmában (szintézise: vese tubuláris rendszerében) Gastrointestinalis glutation peroxidáz (Chu, Esworthy,1995) H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidok vékonybél epithel sejtek Mellékhere extracelluláris glutation peroxidáz (Williams, 1998) - H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidok mellékhere és szeminális plazma (spermium membrán)

Aktivitását befolyásoló tényezők - oxidatív stressz hatások (aktiváció  gátlás) szöveti lokalizáció ( máj >>> agy ) endokrin hatások (androgének, melatonin) életkor (az ivarérésig nő, az öregedéssel csökken) takarmányok zsírtartalma (nagy  csökken az aktivitás) többszörösen telítetlen zsírsavak (növelik: n-6 zsírsavak) fehérjehiányos takarmányozás csökkenti

- szelénhiány (csökkenti - szívizomban akár 96 %-kal is) (kivétel: agyszövet - viszonylag állandó) szükségletet meghaladó mennyiségű szelén kiegészítés (az élettani szint elérése felett tovább már nem fokozza sem az enzimfehérje szintézisét, sem aktivitását) - E-vitamin (növeli a phGSHPx aktivitást a spermiumban)

5’-dejodinázok (aktív centrum SECIS element – szelenocisztein (21.aminosav) I. típus: pajzsmirigy, máj, vese, tobozmirigy II. típus: pajzsmirigy, placenta, tobozmirigy, központi idegrendszer, újszülött rágcsálók zsírszövete III. típus: bőr, placenta, központi idegrendszer 2HI + H2O2  I2 + 2H2O Aktivitását befolyásoló tényezők Szelénhiány – csökkenti TSH – növeli

Glutation-S-transzferázok (specifikus GSH kötőhellyel rendelkeznek) 2GSH  GST GSSG + 2H+ szelén hiányos állapotokban aktiválódnak (nem szelén dependens glutation-peroxidázok) - hatékonyan redukálják a koleszterol-7-hidroperoxidokat a GST A4-4 izoenzim hatékonyan redukálja a 4-hidroxi-2 nonenal-t (agyban) - phGSHPx aktivitást mutatnak

ÉTERIKUS OLAJOK ANTIOXIDÁNS VEGYÜLETEI NÖVÉNYI EREDETŰ ANTIOXIDÁNSOK ÉTERIKUS OLAJOK ANTIOXIDÁNS VEGYÜLETEI HATÁSUK: ELEKTRON DONOR - ANTIOXIDÁNS MEMBRÁN CSATORNÁK VÉDELME (ENTEROCITÁK  FELSZÍVÓDÁS) POLIFENOLOK: FLAVONOLOK – KVERCETIN, KEMPFEROL, MIRICETIN FLAVONOK – APIGENIN, LUTEOLIN TERPÉNSZÁRMAZÉKOK : CITRÁL, CITRONELLÁL, MENTON

SZINTETIKUS ANTIOXIDÁNSOK HATÁSUK: TAKARMÁNYOK ZSÍRSAVAINAK VÉDELME TAKARMÁNYOK OXIDÁCIÓRA ÉRZÉKENY BIOLÓGIAILAG AKTÍV VEGYÜLETEINEK VÉDELME ENTEROCITÁK VÉDELE HATÁSUKAT BEFOLYÁSOLJA: ZSÍRSAVAK MENNYISÉGE ZSÍRSAVAK TELÍTETLENSÉGE - GYÁRTÁSTECHNOLÓGIA

AZ ANTIOXIDÁNS RENDSZER HÁROM VÉDELMI VONALA AZ ÁLLATI SEJTEKBEN ELSŐ VÉDELMI VONAL a további szabadgyök képződés megelőzése ANTIOXIDÁNS ENZIMEK SZUPEROXID DIZMUTÁZ GLUTATION-PEROXIDÁZ KATALÁZ FÉMKÖTŐ FEHÉRJÉK

a láncreakció kiterjedésének megelőzése és megállitása MÁSODIK VÉDELMI VONAL a láncreakció kiterjedésének megelőzése és megállitása ZSIROLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK A- ÉS E-VITAMIN, KAROTINOIDOK, UBIQUINOLOK VIZOLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK C-VITAMIN, GLUTATION, HÚGYSAV

HARMADIK VÉDELMI VONAL a makromolekulák károsodott szakaszainak kivágása és helyreállitása REPAIR ENZIMEK LIPÁZOK – foszfolipáz A2 PEPTIDÁZOK – peroxiszóma enzimek PROTEÁZOK – calpainok (kalcium efflux gáltás) DNS REPAIR ENZIMEK – bázis (oxo-guanozin), nukleotid repair Glutation-reduktáz GSSG + 2NADPH  GSSG-R  2GSH + 2NADP+

Az oxidativ stressz kialakulása fiziológiás és patológiás folyamatok során

Oxidatív stressz: a prooxidáns és az antioxidáns anyagok egyensúlya eltolódik az előzőek javára Az arányeltolódást előidézheti: Külső tényezők: magas hőmérséklet – hőstressz UV sugárzás – fertőtlenítés, napfény hatása ionizáló sugárzás – fertőtlenítés

TAKARMÁNYOZÁSI HATÁSOK Fémtoxikózisok (réz és a vas) Cu(II) + (O2)-  Cu(I) + O2 Cu(I) + H2O2  Cu(II) + (OH) + OH- vagy NO + O2-  ONOO- + ONOOH  Cu(II)  OH + NO2 Fe(III) + (O2)-  Fe(II) + O2 Fe(II) + H2O2  Fe(III) + (OH) + OH Biológiai rendszerekben tiol-Fenton tipusu reakció: Fe(III) + RSH  Fe(II) + RS + H+ Fe(II) + H2O2  Fe(III) + (OH) + OH-

Glutation depléció Előidézheti: éhezés – baromfi fajoknál 24 óra elegendő! metionin hiány cisztein hiány A-vitamin túladagolás gátolja az E-vitamin felszívódását, illetve annak a májban való tárolását

A-vitamin kiegészítés hatása a máj E-vitamin tartalmára brojlercsirkében (Surai és Kuklenko, 2000 nyomán) A-vitamin kiegészítés 42 napos 56 napos (NE/kg) (g /g nedves szövet) 10 18,71 12,40 50 15,19 11,70 100 12,72 9,44 500 10,44 7,12 1000 8,19 5,11 2000 6,19 4,12

Nagy lipid peroxid tartalmú takarmányok felvétele: közvetlenül kevéssé toxikus (májkárosodás, szaporodás- biológiai zavarok, tumor képződés) Peroxidált lipidek metastabil végtermékeinek hatása: Alkanalok - malondialdehid fehérjék tiol- valamint a szabad -lysil csoportjaival való kapcsolódás - LDL oxidáció Alkenalok - 4-hidroxi-nonenal elektrofil vegyületek – reakcióba lép a glutationnal, fehérjék -lysil csoportjaival. Alkánok - pentán kémiai reaktivitásuk kicsi

Nagy peroxid tartalmú takarmányok etetése

Csökkentik az antioxidánsok mennyiségét: Mikotoxinok jelenléte a takarmányokban kémiailag reaktív molekulák (epoxi csoport: AFB1, T-2) Csökkentik az antioxidánsok mennyiségét: 2GSH + O2-  GSSG + H2O Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését  membrán csatornák zavara Ca2+ efflux zavara sejtanyagcsere zavara  lipid peroxidáció

Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését  membrán csatornák zavara Ca2+ efflux zavara „Mitochondrial swelling”  lipid peroxidáció

Akut vagy krónikus stressz hatások - hideg környezet vagy az immobilizáció gyökképző folyamatok intenzitása fokozódik  antioxidánsok mennyisége csökken ( pl. glutation, E-vitamin vagy aszkorbát)

Belső tényezők: fiziológiás folyamatok, genetikai hatások, fizikai terhelés Fiziológiás folyamatok: arachidonsav kaszkád metabolitokendoperoxidok (OOH) prosztaglandinok vagy leukotriének szintézise során ion pumpa müködésének - pl. kalcium efflux - zavara öregedés folyamata maximális élettartam a gerinces fajokban az in vivo gyök- képződés függvénye

Genetikai hatások: szelekció  fokozott anyagcsere intenzitás  fokozott mitokondriális oxidáció  fokozott szabadgyök képződés INTENZÍV ANYAGCSERE szelekció  T4 / T3 átalakulás  O2- termelés  Erőteljes fizikai terhelés: fokozott izommunka  fokozott oxigénfelvétel  fokozott szabadgyök képződés

gyulladásos folyamatok – tartástechnológia /fertőzések NO  NO2- mieloperoxidáz  HOCl  NO2Cl

Az egyes szövetek lipidperoxidáció iránti érzékenysége AGY - különösen érzékeny az oxidációs károsodásokra nagy lipid tartalom  kiemelkedően nagy PUFA tartalom  gyenge antioxidáns védelem SZEM (retina) retina pigment epithel sejtjei - oxidatív hatások  apoptózis EMÉSZTŐTRAKTUS ANTIOXIDÁNS VÉDELEM (glutation-peroxidáz aktivitás) gyomor>nyelőcső>vastagbél> vékonybél (kripta >> bélbolyhok csúcsa) VÉREREK antioxidáns enzimek hiánya + arachidonsav kaszkád

VÖRÖSVÉRSEJTEK oxigén “terhelés”  kifejezett antioxidáns védelem (acatalasaemia (kataláz enzim hiánya) – letális) FEHÉRVÉRSEJTEK jelentős antioxidáns (elsősorban aszkorbinsav) tartalom Aszkorbinsav: T-lymphocyták > B lymphocyták >monocyták Neutrofil granulociták  jelentős oxidatív terhelés  H2O2 termelés – oxidatív burst SPERMIUMOK - rendkívül érzékenyek gyenge antioxidáns ellátottság  mitokondriális rendszer fokozott aktivitása

A SZABADGYÖKÖK HATÁSA EGYES KÓROS FOLYAMATOKRA SZÍV VESE ÍZÜLETEK AGY Microangiopathia, thrombosis Glomerulonephritis Arthrosis Encephalomalatia, hypoxia BŐR VÖRÖSVÉRSEJTEK Dermatosis Oxidatív hemolízis VÉREREK SZABAD GYÖKÖK SZEM Atherosclerosis Cataracta, Retinopathia TÜDŐ RDS, szilikózis TÖBB SZERVET ÉRINTŐ GASTRO-INTESTINALIS RENDSZER Gyulladásos folyamatok, gyógyszer-mérgezések, vas toxikózis, táplálóanyag hiány, tumorképződés Diabetes, pancreatitis, intestinalis ischemia