A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga 1 előadás A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el: http://biotech.szbk.u-szeged.hu

A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI   Fő ok: Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje csak körülményesen nyerhető.   KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS IPARI, proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok, polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati felhasználásra KUTATÁSI CÉLOKRA   biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek, 3 dimenziós röntgenszerkezet, mutációs analízis, FELTÉTEL: A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns megfelelője biológiailag ekvivalens

DNA RNA 1 U H 3 OH 2

A DNS felépítése

DNS-olvadáspont Tm= az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt. Streptococcus DNS olvadási görbéje. Tm= az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt.

A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés

Annealing vagy Hibridizáció Lehet DNS - DNS DNS - RNS RNS - RNS

DNS-struktúrák “A” DNS “B” DNS “Z” DNS

Egyéb tisztítási módszerek DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető   Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik. Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak (vortexes kevertetés) nem tehető ki! Egyéb tisztítási módszerek   kromatográfia, - ioncserés DEAE (dietil-aminoetil) kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén A DNS savas  ionos kölcsönhatás hordozó - szilikagél alapú elválasztás magas sókoncentráció mellett felkötődik a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik

RNS tisztítása - CsCl sűrűséggradiens centrifugálás adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez, a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll. különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaság RNS tisztítása RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilak a tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent DEPC: dietil pirokarbonát

RNS tisztítása sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol-kloroform oldattal történő extrakció egy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció. A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható guanidin és izotiociánsav sója

eukarióták esetén stabil poliA farok mRNS tisztítás eukarióták esetén stabil poliA farok AAAAAAAAA mRNS hordozó tRNS rRNS TTTTTTTTTT- magas só AAAAAAAAA mRNS TTTTTTTTTT- hordozó alacsony só AAAAAAAAA mRNS

DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS denaturáló nem-denaturáló lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) Nincs roncsoló ágens méret > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp Mátrix agaróz agaróz 0.5- 2% poliakrilamid technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos LÁTHATÓVÁ TÉTEL: etídium bromid, interkaláló festék Þ nem-denturáló körülmények, elsősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is. A DNS 254 nm-en elnyel Þ energia a festékre Þ 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény között radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók .

Agaróz szerkezete etidium bromid & DNS

Horizontális gélelektroforézis

Géldokumentáció

Poliakrilamid gél futtató berendezés

Vertikális gélelektroforézis (PAGE)

DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL - közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t - a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével AGARÓZ dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos kicsapással, univerzális, széles mérettartomány - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális - kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik, a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén jó a kitermelés POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

DNS/ RNS MÉRÉSE Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos. A különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van. Egyszálú DNS esetén: e(cm3/(µmol * cm) bázis dA 15.4 dG 11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan e = 10 (cm3/(µmol * cm) Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos. Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul 1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája 50 µg/ml kettősszálú DNS-t 33 µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú RNS-t tartalmazó oldatnak A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A260nm/A280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző A260nm/A280nm  2  tiszta a preparátum A260nm/A280nm  1 - 1,5  sok a fehérje szennyezés Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel.

1 előadás 1 előadás