Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése 2014.04.08.

Miről fogunk tanulni? Proteinek kinyerése komplex mintákból (szövet, fermentlé stb.) Nem protein jellegű szennyezők (lipidek, nukleinsavak, stb.) eltávolítása Protein szennyezők eltávolítása (precipitáció, frakcionálás, szelektív jelölés) Mérésnek megfelelő koncentráció beállítása

Analitikai célú (kis térfogatú) vizsgálatok Proteomika (összetétel, funkció, változás) Klinikai vizsgálatok (kórképek, terápia) Szerkezeti vizsgálatok (mutáció, PTM) Térbeli elhelyezkedés (sejtek közti különbségek)

Nehézségek-mielőtt hozzákezdünk Nagyfokú diverzitás (összetétel, koncentráció) élesztősejt: 50-106 db/sejt vérszérum: 60-80 mg/L (3/4 Alb + Ig) mAb: 150 kDa, 108 db elméleti variáns Jól definiált std-ek hiánya Analitikai problémák: 2-3 nagyságrend tartomány (5-12 mintában) felbontóképesség (komponensek száma nagy) érzékenység nem elég (abundáns fehérjék) Minta stabilitása: homeosztázis, proteázok, precipitáció, adszorpció, műtermékek

Plazma proteinek

Néhány szám-komplexitás

NINCS (elfogadható van) Jó mintaelőkészítési protokoll: univerzális mátrixra, szelektív analátra, nem változtatja meg az analátot NINCS (elfogadható van) Lehetőleg kevés lépésből áll (veszteségek) Tisztázni kell: analitikai cél minta forrása, mennyisége technikák alkalmazhatósága (pl. LOQ) mintaszám: idő/költséigény protokoll kidolgozása (irodalom, tapasztalat, intuíció) legyen több alternatíva

Néhány analitikai technika teljesítménye

Mintatípusok Nedvek: vér, vizelet, stb. relatíve homogének, alacsony enzimaktivitás, egyszerű kezelés Szövetek: feltárás szükséges, homogenizálás, magas enzimaktivitás, proteinek beoldása Rekombináns sejtek: sejtes elemek feltárása, majd hasonlóan a szövetekhez

Minták stabilizálása Fagyasztás folyékony nitrogénben Kémiai/fizikiai denaturáció (sók, szerves osz., T) Stabilizáló enzimek (pl. proteáz inhibitorok) Precipitáció (visszaoldás?) Gyors, kontrollált hőmérsékletű feldolgozás

Sejtfeltárás (lízis: lágy, moderált, kemény) Megfelelő hatásfokú feltárás, a célprotein beoldása Zavaró komponensek kicsapása Frakcionálás: centrifugálás hatásfok Károsodás veszélye

Stabilizáció Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: megelőzés: Lágy lízis, enzimgátlás (hő: irreverzibilis denat., kémiai: reverzibilis, aktivitás megőrízhető):

Stabilizáció 2. Detergensek: SDS, oktil-glikozidok, stb. Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: Oxidáció: redukálószer (DTT) Konformációváltozás: fiziológiás extrakció: T: 36°C, pH: 7.4 10mM foszfátpuffer, ionerősség: 0.15 M NaCl Oldatban tartás: Hofmeister-sor (1888, tojásfehérjék) Detergensek: SDS, oktil-glikozidok, stb. precipitál: hidrofób kölcsönhatások erősítése szolvatál: hidrofób kölcsönhatások gyengítése (kaotróp), denaturáció

Példa protokoll: szöveti fehérjék vizsgálata Mintavétel: izomszövet (tárolás: foly. nitrogén) Homogenizálás: fagyasztva őrlés Extrakció: extrakciós puffer, ultrahang Fázisszeparálás: centrifuga (20000g, 20min) Felülúszó további előkészítése, pl. proteolízis Minta vizsgálata

Minta vizsgálata (mátrix egyszerűsítés) Differenciálprecipitáció Prefrakcionálás (IEF, 1-2D SDS PAGE, IEX, SEC, RP) Immunodepletálás (abundánsok eltávolítása) Immunodúsítás (pl. foszfo/gliko stb. proteinek/peptidek) Membránszűrés (3-100 kDa MWCO)

Differenciálprecipitáció

Dúsítás-sómentesítés MS Gyors (komplexebb minta) SDS-PAGE Futtatás Festés Kivágás Visszoldás MS Lassú (tiszta minta) SEC Frakciószedés Dúsítás-sómentesítés MS Gyors (komplexebb minta)

Immunodepletálás/immunodúsítás

Membránszűrés

HTS módszerek (sok minta)

Szerkezetvizsgálatok-mintelőkészítés (mAb példája) Intakt fehérjék nehezen vizsgálhatók: LC: diffúzivitás (anyagátadási ellenállás) adszorpció (T, additív, P) MS: tömegtartomány (m/z 2-10000:Q, ToF) felbontás (Gln:128.14, Lys:128.17; 50000 (1500 Da peptid)) Megoldás: karakterizáljuk a peptideket!

mAb Szekvencia (de novo szekvenálás) Proteolízis: tripszin (Lys, Arg C-term), pepszin, kimotripszin, Glu-C, stb.. peptidek szekvenálása MS-ben 100% lefedettség kell (nagyon nehéz, több enzimet kell használni) Töltésvariánsok PTM Aggregáció És ez még messze nem elég!!!!

proteolízis protein oldat pH beállítás S-S redukálás (DTT), denaturáció (detergens alkilálás (IAA) pH, T beállítás tripszines emésztés:1000-1500 Da peptidek (autoproteolízis gátolt, specificitás?) peptidek (nano)LC-MS/MS

LC-MS/MS Adatfüggő analízis Target analízis

Töltésvariánsok: IEC (papain)

Oxidált variánsok: RP (DTT)

Fragmensek, aggregátumok: SEC

Konklúziók Érzékeny, bonyolult minták Többlépéses mintaelőkészítés Protokollt a feladat határozza meg Költségesebb Nagyobb körültekintést igényel Kisebb reprodukálhatóság Aki jól csinálja, annak lesz munkája