REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER Reichart Olivér Szakmár Katalin

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 1. Klasszikus (tenyésztéses) módszerek Hosszú inkubációs idő (1-4 nap) A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-hatósága és költsége tartományfüggő Nagy koncentrációknál: Hígítás és telepszámlálás a 30-300 cfu/ml tartományban Alacsony koncentrációknál: MPN módszer Membrán szűrés

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2. Gyors mérési módszerek 1. (sejtszámlálás alapján) Direkt számlálás Számlálókamra Flow cytometer Csak tiszta folyadékban alkalmazható Turbiditásmérés

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2 Gyors mérési módszerek 2. (Anyagcseretermék detektálása alapján) ATP mérés Csak 105 sejt felett alkalmazható Impedancia mérésen alapuló módszerek Malthus Rabit Bactrac

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 3. Impedimetriás gyors módszerek Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon drága berendezés. Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot igényel. Probléma a szelektív szubsztrátokkal. A mérő cellák geometriája és térfogata adott. Kis koncentrációknál megbízhatatlan.

Redoxpotenciál mérésen alapuló módszer elvi alapjai Kémiai reakció általános formában: a A + b B c C + d D [C]c [D]d Q = ------------ [A]a [B]b

Szabad energia és elektromos munka DG = DG° + R T ln Q DG = - n FDE. -n F DE = - n F DE° + R T ln Q

DE = DE° - ------- ln --------- Elektromotoros erő R T [C]c [D]d DE = DE° - ------- ln --------- n F [A]a [B]b

Biológiai rendszerekben Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez. A környezet redukciójának okai lehetnek: Oxigén elfogyasztása Redukált komponensek feldúsulása Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai rendszerekben: [Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

Eh = E0 - ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+] Nernst egyenlet: RT [reductant] Eh = E0 - ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+] RT [oxidant] [H+] Eh = E0 + ----- ln ------------------- nF [reductant] Eh : a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott redoxpotenciál (V) E0 : A rendszer normál redoxpotenciálja (V) R: Gáz-állandó R = 8.314 J/mol K F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V mol) n: elektronok száma a redox-reakcióban (n=1)

Mikroba-szaporodás redox-görbéje

Különböző baktériumok redox-görbéi

A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére

Detektációs kritériumok Impedimetriás módszerek RABIT: admittancia változás > 5 S/6min BACTRAC: impedancia változás > 5% Redox-potenciál mérés: |E/ t|>1mV/min Detektációs idő (TTD): A detektációs kritérium eléréséhez szükséges idő

A kezdeti sejtszám hatása a detektációs időre

Mérőcella redoxpotenciál méréshez 1.

Mérőcella redox-potenciál méréshez 2.

Indirekt mérőcella

Mérőcella hatása a redox-görbére

Enterococcus faecalis különböző cellákban mérve

12 csatornás mérő-rendszer Vízfürdő Mérőcellák Adatgyűjtő Computer Monitor Software for Windows

Termékben való közvetlen mérés

Termékben való közvetlen mérés

16 csatornás mérési elrendezés

32 csatornás mérési elrendezés

2 csatornás mérési elrendezés

Mozaik elrendezésű képernyő

Csoportosított gráfok

Mérési eredmények megjelenítése

Mérési eredmények megjelenítése

Mérési módszer validálása

Teszt-mikrobák és táptalajok 1. Microorganisms Redox potential Plate counting Escherichia coli BBL, TSB TSA, Tergitol Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Klebsiella oxytoca Acinetobacter lwoffii Pantoea agglomerans

Teszt-mikrobák és táptalajok 2. Microorganisms Redox potential Plate counting Pseudomonas aeruginosa Cetrimide, TSB TSA, Cetrimide Pseudomonas fluorescens Enterococcus faecalis Azide, TSB TSA, Slanetz-Bartley Total count TSB TSA

A módszer validációs jellemzői 1. Szelektivitás A szelektív médium által adott. Linearitás 1-től 107 cfu/mérőcella.

Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E. coli és Enterococcus faecalis Cetrimid-levesben

Enterococcus faecalis meghatározás linearitása

Pseudomonas aeruginosa meghatározás linearitása

E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel

Impedimetriás és redox-módszer összehasonlítása

A módszer validációs jellemzői 2. Érzékenység Kimutatási határ (Detectation limit) 1 cell/test flask. Meghatározási határ (Quantitation limit) Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum (1 log egység), ami megegyezik a kapott kalibrációs görbékkel.

A módszerek érzékenysége

A módszer validációs jellemzői 3. Tartomány A kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend. 10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz problémát, 107 sejt felett a TTD túl rövid a tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-, redox-egyensúly, lag-periódus). Ismételhetőség A kalibrációs görbékből számítva: SDlgN = 0.092 SDN = 100.092 = 1.24 = 24%

A módszer validációs jellemzői 4. Zavartűrés (Robustness) Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely két módon befolyásolja az eredményeket: szaporodási sebesség hőmérséklet-függése redox-potenciál hőmérséklet-függése A mikroba szaporodási optimumán mérve, a szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon belül nem változik. A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint elhanyagolható.

Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra

A hőmérséklet hatása a mérési módszerekre Impedimetriás módszerek: A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő. A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5% növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual). Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási követelménynek (T=±0.002°C). Redox-potenciál mérés: A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-szaporodás határozza meg. A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.

Impedimetriás és redox mérési módszerek hőmérséklet-érzékenysége Impedimetric method Redox-potential 1°C változás hatása (Szubsztrát-függő) 20-200S 0.4-1.4mV Hamis pozitív eredményt adó hőmérséklet-változás 0.004°C/min 0.7-2.5 °C/min Szokásos méréshez tartozó kritikus hőfok-csúszás 0.025°C/6min 7-25 °C/10min

A redox-módszer alkalmazása Víz mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Coliform, E. coli Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Nyers tej mikrobiológiai minősítése Enterobacteriaceae Hús mikrobiológiai ellenőrzése Felületek mikrobiológiai ellenőrzése Penész- és élesztőgombák számának meghatározása

Víz mikrobiológiai vizsgálatok Összcsíra

Víz mikrobiológiai vizsgálatok Coliformok

Víz mikrobiológiai vizsgálatok Pseudomonas aeruginosa

Víz mikrobiológiai vizsgálatok Enterococcus faecalis

Ipari validálási eredmények 1. 72 palack vizsgálata Coliform mikrobákra Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra. Redox-potenciál mérési módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. 4 membrán behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 12 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpensio (lgN = 3.66)

Ipari mérések eredménye 1.

Ipari mérések eredménye 1. 72 palack vizsgálata coliform mikrobákra Minták 1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72. Laboratory negative Redox

Ipari validálási eredmények 2. 66 palack vizsgálata Coliform mikrobákra Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra Redox-potenciál mérési módszer Membran szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. 3 membran behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 9 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra. Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpenzió (lgN = 6.66)

Ipari mérések eredménye 2.

Ipari mérések eredménye 2. 66 palack vizsgálata coliform mikrobákra Minták 1.-66. Bottles Water sample 1. Water sample 2. Laboratory results negative Redox method

Nyers tej össz-mikroba száma

Enterobaktériumok tejben

Nyers hús össz-mikroba száma

Enterobacteriaceae húsban

Felületi tamponos vizsgálatok

Redox-potenciál változás gombák szaporodása során (indirekt mérés)

Saccharomyces cerevisiae kalibrációs görbe

Aspergillus niger kalibrációs görbe

A redox mérési módszer előnyei 1. Egyszerű mérési technika. Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást. Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú fertőzések esetében. Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás mérések kis vezetőképességű, speciális tápleveseket igényelnek). Különösen alkalmas membrán-szűréses módszer kiértékelésére.

A redox mérési módszer előnyei 2. Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére. Nagyon hatékony módszer táptalaj-optimalizálási kísérletekhez. A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus módszerekhez viszonyítva, különösen null-toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus, Pseudomonas, etc.) meghatározásánál