UV-VIS MOLEKULASPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK .

1. Elektronok gerjesztési lehetőségei a molekulákban Molekulák létrejöttekor az atompályák kombinációjának következtében a molekulapályák két sorozatához (kötő ill. lazító) jutunk. Ha a molekula elektromágneses sugárzást nyel el az alacsonyabb energiájú kötőpályán lévő elektron a magasabb energiájú lazítópályára gerjesztődik. 1. ábra. A formaldehid (H2C=O ) molekulapályái ill. elvileg lehetséges elektronátmenetei

1.1. A lehetséges elektronátmenetek jellemzői - egyszeres kötésben részt vevő elektron gerjesztésekor jellemző, - az átmenet gerjesztésére nagy energiájú, távoli ultraibolya sugarak alkalmasak, - általában nem vizsgálhatóak, mert a gerjesztéshez szükséges sugárzás hullámhossza kisebb, mint 200 nm (itt a levegő oxigénje is gerjesztődik ill. a molekula széteshet) π → π * átmenet - a telítetlen kettős és hármas kötéseket tartalmazó vegyületekre jellemző, - a gerjesztéshez kisebb energia szükséges, mint az egyszeres kötéseknél, így a közeli UV-ben, esetenként a látható tartományban gerjeszthető. n → σ * és n → π * átmenetek - nem kötő, magános elektronpárral rendelkező heteroatomot (O, N, S, halogének) tartalmazó vegyületekben lehetségesek: - n → π * átmenet esetében ez az atom kettős kötésben, illetve heteroaromás gyűrűben található (C=O, C=N, piridin), - n → σ * átmenet esetében egyes kötéssel kapcsolódik a molekulához (alkoholok, éterek, alkil/aril-halogenidek).  . 3.1.2. Az UV-VIS-spektrumok felvételének körülm

1.2. Kiválasztási szabályok Megszabják, hogy mikor megengedett vagy tiltott két molekulapálya között az elektronátmenet: A különböző spin multiplicitású állapotok (szingulett → triplett) között az átmenet tiltott, azonosak között megengedett. Elektronátmenet olyan pályára megengedett, melynek ugyanolyan szimmetriája van, mint az alapállapot szimmetriája és amelynek több csomósíkja van, mint az alapállapot elektronpályájának. Ortogonális, azaz egymásra merőleges pályák közti átmenetek tiltottak (pl. C=O csoport n → π * átmenete). Tiltott elektronátmenethez tarozó sávok vagy meg sem jelennek a spektrumban vagy nagyon kis intenzitásúak ( ε értéke nagyon kicsi) . Pl. a C=O csoport acetaldehidben (gőz állapotban): n → π * átmenet: λmax =298 nm ε= 12.5 dm3mol-1 cm-1 π → π * átmenet: λmax =182 nm ε= 10000 dm3mol-1 cm-1

2. ábra: A karbonil csoport (>C=O) molekulapályái és 2. ábra: A karbonil csoport (>C=O) molekulapályái és elelektronátmenetei

1.3. Az abszorpció hullámhosszát befolyásoló tényezők Az elektron gerjesztéséhez szükséges energiát (a gerjesztő foton hullámhosszát, vagyis az elnyelési sáv helyét a spektrumban ) a kémiai kötés erőssége határozza meg, amely ily módon jellemző a kötést létrehozó atomokra. Ez a minőségi analízis alapja. Kromofórok: az abszorpciót okozó atomcsoportok. Auxokróm csoportok: maguk nem abszorbeálnak, de a kromofórokkal kölcsönhatásba lépve (molekulapályák közötti konjugáció) megváltoztatják az abszorpciós sáv a. hullámhosszát: hullámhossz növekedése: batokróm eltolódás, hullámhossz csökkenése: hipszokróm eltolódás, b. intenzitását: abszorbancia növekedése: hiperkróm eltolódás, abszorbancia csökkenése: hipokróm eltolódás.

1.4. A molekulapályák közötti konjugáció A konjugáció elektroneltolódással járó effektus, amely π – π, n – π ill. σ - π pályák között jöhet létre: π – π konjugáció: a π pályák közötti kölcsönhatás eredményeképpen policentrikus molekulapályák jönnek létre, aminek következtében kis energiájú π – π* átmenetekre van lehetőség, így a konjugált rendszer a nagyobb hullámhosszakon abszorbeál. (batokróm hatás, lásd. 3. ábra). n – π konjugáció: kromofór és auxokróm csoport között létrejövő kölcsönhatás, amikor a heteroatom (pl. halogén ) magános elektronpárja delokalizálódik a π -rendszeren, aminek következménye szintén a nagyobb hullámhosszakon történő abszorpció (batokróm hatás , lásd 4. ábra). σ - π konjugáció (hiperkonjugáció): a σ kötés elektronpárja kölcsönhatásba lép a π renndszerrel, az abszorpció a magasabb hullámhosszak felé tolódik el (batokróm hatás, pl. metil-csoport kölcsönhatása az aromás π renszerrel a toluolban)

3. ábra. π – π konjugáció

4. ábra. n – π konjugáció

1.4. A molekulaspektrumok sávos jellege Atomok belső energiájának megváltozása: ΔEatom = ΔEelektron = hν Következmény: vonalas (0.005-0.02 nm) spektrum. Molekulák belső energiájának megváltozása: ΔEmolekula = ΔEelektron + ΔErezgési + ΔEforgási = hν Vagyis: egy foton abszorpciója egyidejűleg okozhatja mindhárom állapot megváltozását! Következmény: sávos (10-50 nm) spektrum. ΔEelektron ~ 10·ΔErezgési ~ 10· ΔEforgási

1. Ábra. Molekulák gerjesztési lehetőségei (az elektron-rezgési-forgási spektrum)

2. ábra. Kétatomos molekula potenciális energiája az atomtávolság. fv 2. ábra. Kétatomos molekula potenciális energiája az atomtávolság fv.nyében - a potenciálgörbék minimumai közötti távolság az elektron gerjesztéséhez szükséges energia - gerjesztett állapotban nagyobb a magtávoság és kisebb a disszociációs energia, ezért a gerj. állapotok görbéi jobbra tolódnak el és laposabbak.

3. ábra. Az akridon sávos spektruma

2. Molekulaspektroszkópiai módszerek csoportosítása

2. Mennyiségi analízis 2.1. Lambert-Beer törvény: egy adott λ= áll. hullámhosszon, híg oldatokban: A = -lg T = ε·l·c T = It/I0 ahol A ( - ) abszorbancia T ( - , vagy %) transzmittancia It , I0 az áteresztett (transzmittált) ill. a beeső fény intenzitása c (mol/dm3) koncentráció l (cm) optikai úthossz ε (dm3·mol-1·cm-1) moláris abszorpciós koefficiens Egy adott vegyületnél minden abszorpciós csúcshoz más hullámhossz, ezért más ε tartozik, vagyis minden hullámhosszra más-más LB törvény írható fel!

3. Mennyiségi analízis Az abszorbancia additív: ha egy oldatban az adott hullámhosszon több komponens is elnyel a mért abszorbancia az egyes komponensek abszorbanciáinak összege: A = Σ Ai = A1 + A2 +…+An = ε1·l·c1 + ε2·l·c2 +….+ εn·l·cn Kétkomponensű elegy összetételének meghatározása: Két olyan hullámhosszon (λ1, λ2) mérünk, ahol mindkét komponens elnyel: 1. Először meghatározzuk a tiszta komponensek moláris abszorpciós koefficienseit a két hullámhosszon (ε11 , ε12, ε11 , ε12) , 2. Megmérjük az elegy abszorbanciáját a két hullámhosszon (A1, A2) 3. Megoldjuk a 2 db két ismeretlenes (c1, c2 )egyenletet: A1 = = ε11·l·c1 + ε12·l·c2 A2 = = ε21·l·c1 + ε22·l·c2

2. Mennyiségi analízis 2.2. Eltérések a Lambert-Beer-törénytől 2.2.1. Tömény oldatokban (c > 10-2 M) ε nem független a koncentrációtól, mivel az oldat törésmutatója a koncentráció növelésével nő. 10-2 M-nál nagyobb koncentrációk esetén: ε* = ε·n / (n2+2)2 ahol n az oldat törésmutatója 2.2.1. Híg oldatokban (c < 10-2 M) 2.2.1. 1. Kémiai okokra visszavezethető eltérések A mérendő oldatban disszociáció, asszociáció, szolvatáció, komplexképződés játszódhat le, aminek következtében az abszorbeáló részecskék koncentrációja megváltozik. A jelenség felhasználható egyensúlyi állandó meghatározásához. Pl. így meghatározható indikátorok pKi értéke: az indikátorok két formája (nem disszociált molekula ill. anion) egymástól eltérő színű, mivel más-más szerkezetűek →más-más hullámhosszon abszorbeálnak.

Egyensúlyi állandó meghatározása Az indikátor (mint gyenge sav) disszociációs egyensúlya: HIn ↔ H+ + In- Egy λ=áll. hullámhosszon, ahol mindkét forma elnyel valamilyen mértékben, három pH értéknél mérünk: pH1 = 0 (erősen savas közeg): itt az indikátor (gyenge sav) nem disszociál, csak HIn formában van jelen, melynek elnyelése: AHIn = εHIn·l·c Ebből ismert c konc. oldat esetén εHIn meghatározható. 2. pH2 = 14 (erősen lúgos közeg): itt az indikátor (gyenge sav) teljesen disszociál, csak In- formában van jelen, melynek elnyelése: AIn = εIn·l·c 3. pH3 ~ pKi környékén: az indikátor részlegesen disszociál, mindkét forma jelen van, melyek elnyelése: A = AHIn + AIn = εHIn·l·cHIn + εIn·l·cIn mivel: c = cHIn + cIn, a két egyenletből cHIn és cIn számítható. Az egyensúlyi állandó: Ki = (H+) · (In- ) / (HIn) = 10-pH3 · cIn / cHIn

Izobesztikus pont Ha a kémiai egyensúly mindkét partnere (pl Izobesztikus pont Ha a kémiai egyensúly mindkét partnere (pl. HIn és In-) abszorbeálja a sugárzást, és található olyan λ1, ahol εHIn> εIn, valamint olyan λ2, ahol εHIn< εIn, akkor a görbék folytonossága miatt lennie kell legalább egy olyan hullámhossznak, ahol εHIn= εIn , azaz a görbék metszik egymást. Ezt a metszéspontot izobesztikus pontnak nevezzük. Az izobesztikus pont hullámhosszán mérve meghatározható a vegyület összkoncentrációja.

2.2.1. 1. Fizikai okokra visszavezethető eltérések A besugárzó fény (I0) nem szigorúan monokromatikus (Δλ szélességű) Keskeny éles csúcsok esetén ez jelentős hibát okozhat, ezért célszerű az elnyelési sáv maximumához tartozó hullámhosszon mérni. A hőmérséklet hatása Alacsonyabb hőmérsékleten az abszorpciós sáv szélessége csökken ( a csúcs élesedik), mivel csökken a gerjesztett forgási és rezgési nívók betöltöttsége. A sávmaximum helye a kisebb hullámhosszak felé tolódik el. Az abszorbancia hőmérsékletfüggése 1-1.5 %/C0 A mérés során változik a fényforrás intenzitása , vagy a jelfeldolgozó erősítése Melegszik a lámpa, ezért jobban emittál. A hiba kiküszöbölhető két fényutas készülék alkalmazásával. Változik a detektor érzékenysége (az idő függvényében) Ezért jobban preferált a két sugárutas egy detektoros készülék.

3. UV-VIS spektrofotométerek A készülékek fő egységei: Fényforrás: folytonos emissziós spektrumot szolgáltató fényforrás (lámpa) UV-tartomány: deutérium lámpa Látható tartomány (VIS): wolfram-halogén lámpa 2. Fényfelbontó egység: optikai szűrő (üvegszűrő vagy interferencia szűrő) monokromátor (prizmás, optikai rácsos) 3. Mintatartó: küvetta (folyadék mintákhoz) speciális gázküvetta (gáz halmazállapotú mintákhoz) speciális mintatartó szilárd mintákhoz (fóliák, fényvédő krémek, UV-szűrő üvegek vizsgálatához) A mintatartók anyaga az UV-tartományban kvarcüveg, a látható tartományban kvarcüveg, normál üveg ill. műanyag (plexi).

4. ábra. Különböző folyadéktartó küvetták

UV-VIS spektrofotométerek 4. Detektor: fotocella fotoelektron sokszorozó fotodióda CCD 5. Jelfeldolgozó, kijelző egység: analóg (mutatós) műszer PC (megfelelő adatfeldolgozó szoftverrel) Spektrofotométer típusok: egy fényutas két fényutas – egy detektoros - két detektoros

5. ábra. Spektrofotométer típusok

6.a. ábra Kétsugárutas, egy detektoros spektrofotométer

6.b. ábra. Diódasoros spektrofotométer

4. Alkalmazások 4.1. Minőségi analízis: funkciós csoportok felismerése A módszer önállóan nem használható szerves vegyületek szerkezetének meghatározására (széles egymást átfedő sávokat tartalmazó spektrum →kevés információ) , de más módszerekkel (IR, NMR, MS) együtt alkalmazva hasznos információkat szolgáltat. 4.2. Egyensúlyi állandók meghatározása: Kromofór csoportot tartalmazó gyenge savak, bázisok (pl. indikátorok) disszociációs állandóinak meghatározása. 4.3. Titrálási folyamatok végpontjelzése: Ha titrálandó vegyület, a reagens vagy a keletkező termék közül valamelyik abszorbeál a végpont fotometriásan jelezhető. Akkor is működik, ha az oldat színes vagy nincs indikátor, vagy az átcsapás rosszul észlelhető (lásd ábra). 4.4. HPLC készülékek detektoraként diódasoros detektor → háromdimenziós spektrum 4.5. Fémionok mennyiségi meghatározása

7. ábra. Fotometriás titrálási görbék

4.5. Fémionok spektrofotometriás meghatározása A meghatározás alapja: A fémionok szerves ligandumokkal színes komplexeket képeznek. A legtöbb szervetlen fémvegyület színtelen, viszont a komplexképző ligandum hatására a fémionok ötszörösen degenerált d-atompályái felhasadnak és így létrejön egy, a látható fény fotonjával gerjeszthető d-d átmenet (lásd ábra). A komplexképzés szelektív, a keletkező komplex stabil és intenzíven abszorbeál (nagy abszorpciós koefficiens), így nagyon érzékeny módszerek ismertek, akár 10-5 M koncentrációjú oldatok is mérhetők. A kationokhoz hasonlóan számos anion (klorid, nitrit, nitrát, foszfát) is meghatározható megfelelő szerves reagensekkel. Pl. Fe2+: 1-10-fenantrolin, pH = 4, λ = 510 nm Fe3+: NH4SCN, pH = 1, λ = 490 nm szulfoszalicilsav pH = 1-4, λ = 500 nm

8. ábra. Átmeneti fémek d-elektronpályáinak felhasadása a ligandum hatására

FLUORIMETRIÁS MÓDSZEREK .

1. Alapjelenségek, definíciók Lumineszcencia: Az anyag a különböző módon felvett gerjesztési energiát elektromágneses sugárzás formájában (foton kibocsájtásával) adja le. A lumineszcencia fajtái: kemilumineszcencia: kémiai reakcióban gerjesztett állapotú molekula (termék, közti termék) keletkezik. Ha biokémiai (enzim katalizálta) reakcióban keletkezik: biolumineszcencia. Fotolumineszcencia: a molekula gerjesztése elektromágnenses sugárzással történik fluoreszcencia: a gerjesztés ill. a relaxáció alatt a gerjesztett elektron spin állapota nem változik meg, ezért a jelenség gyors. foszforeszcencia: a gerjesztés ill. a relaxáció közben a gerjesztett elektron spin állapota megváltozik . Mivel az ilyen átmenet tiltott(ezért kis valószínűségű), a gerjesztés és a relaxáció között viszonylag sok idő telik el.

1. ábra. Biolumineszcencia (szentjánosbogár)

2. Fluoreszcencia ill. foszforeszcencia létrejötte fotonabszorpció: az elektron a gerjesztett állapot egy magasabb rezgési szintjére kerül 1.a. rezgési relaxáció: a molekula alacsonyabb rezgési szintre kerül 2. fluoreszcencia: az elektron a gerjesztett állapot legalsó rezgési szintjéről fotonemisszióval az alapállapot valamelyik rezgési szintjére kerül. Frank-Condon-elv: a foton emissziója mindig a gerjesztett állapot legalsó rezgési szintjéről történik. 3. külső átalakulás (quenching, kioltás): fotonemisszió nélküli (pl. ütközéses) relaxáció 4. intercrossing system(belső átrendeződés): az elektron spinje átfordul, a molekula szingulett állapotból triplett állapotba kerül 4.a. rezgési relaxáció: a molekula alacsonyabb rezgési szintre kerül 5. foszforeszcencia: az elektron újabb spinátfordulás után fotonemisszióval az alapállapot valamelyik rezgési szintjére kerül. 6. külső átalakulás (quenching, kioltás): fotonemisszió nélküli (pl. ütközéses) relaxáció

2. ábra. Molekulák energialeadásának módjai

3. ábra. Különböző spinállapotok

2. Fluoreszcencia és a molekulaszerkezet 2.1. Mely molekulák fluoreszkálnak? A delokalizált π-kötéseket tartalmazó aromás vegyületek, többszörösen konjugált kettős kötéseket tartalmazó vegyületek (pl. poliének). 2.1. Milyen hatások befolyásolják a fluoreszcenciát? Minél merevebb egy molekula, annál inkább hajlamos a fluoreszcenciára, mivel a merevség (és a nagy tömeg) csökkenti a rezgésre való hajlamot , így a gerjesztési energiát inkább kisugározza. A molekulában a kromofórhoz kapcsolódó szubsztituensek befolyásolják a fluoreszcencia erősségét: - Az elektronküldő csoportok (-OH, -NH2, -O-alkil, -N-alkil) növelik Az elektronvonzó csoportok (-COOH, -NHCOCH3) csökkentik, vagy teljesen kioltják (-NO, -NO2, halogének). Ha a szubsztituens savas vagy bázikus jellegű a flureszcencia pH-függő A hőmérséklet csökkenti a fluoreszcenciát, mert az oldatban nő a molekulák kinetikus energiája (mozgékonysága), így az ütközéses kioltás valószínűsége. Az erős van der Waals kölcsönhatásra képes oldószerek növelik az ütközéses kapcsolat idejét, így csökkentik a fluoreszcenciát.

4. ábra. A molekulaszerkezet hatása a fluoreszcenciára Fluorén: merev szerkezet ( a metil csoport miatt) nagy hajlandóság a fluoreszcenciára kvantumhatásfok (Φk) = 1 Bifenil: rugalmas szerkezet, a két fenil csoport külön-külön könnyen rezgésbe hozható, a molekula alig fluoreszkál kvantumhatásfok (Φk) = 0.2

5. ábra. Fluoreszkáló anyagok: 1. Aminosavak fluoreszcencia spektruma 2. Fluoreszcein molekula (festék, indikátor) 3. Fluoreszkáló fehérjemolekula (GFP, Green Fluorescent Protein), 2008: kémiai Nobel díj Gerjesztés: 396 nm UV, 475 nm kék Emisszió: 508 nm zöld Fluorofór csop.: szerin-tirozin-glicin

2.3. A fluoreszcenciaspektrum A fluoreszcencia spektrum tükörképe az abszorpciós spektrumnak, csak a fluoreszcencia spektrum sávjai a nagyobb hullámhosszak felé eltolódnak. 6. ábra. Akridon flureszcenciaspektruma

3. Mennyiségi analízis A fotolumineszcenciás (fluoreszcenciás, foszforeszcenciás) módszer mérési elrendezése és analitikai függvénye

4. A fluoreszcencia alkalmazásai 4.1. Az abszorpciós és fluoreszcens módszer összehasonlítása - A fluoreszcencia intenzitása (IF) növelhető a megvilágító fényforrás intenzitásának (I0)növelésével, így nő a mérés érzékenysége, sokkal kisebb kimutatási határok (akár 10-8 M) érhetők el. - Mivel kevés anyag fluoreszkál számottevő mértékben, ezért szelektívebb, mint az abszorpciós módszer. - Hátránya, hogy nem robosztus, a fluoreszcencia mérések nagyon érzékenyek a pH-ra, hőmérsékletre, oldószerre, kioltó anyagok jelenlétére. 4.2. Gyakorlati alkalmazási lehetőségek fluoreszkáló vegyületek mérése nem fluoreszkáló de kémiai reakcióval (származékképzés) azzá tehető vegyületek meghatározása (kromatográfia, immunoassay) nem fluoreszkáló, de a fluoreszcenciát kioltó anyagok meghatározása alkalmazás HPLC detektorokként