OECD ajánlás vegyi anyagok vizsgálatára Laboratóriumi körülmények között bőr korrózió vizsgálata: Transzkután Elektromos Ellenállás Teszt (TER).

Bevezetés A bőrkorrózió egyet jelent a bőr kötőszöveteiben jelentkező visszafordíthatatlan károsodással, a tesztelt anyagokkal való érintkezés után. Ez az Ajánlás olyan eljárást javasol, melyben élő állat nem szenved károsodást, fájdalmat azáltal, hogy alternatív módszereket használ. A legfőbb akadály, hogy helyettesítsék az in vivo módszereket az egységes, független, hivatalos in vitro módszerek hiánya volt. Első lépésként előtanulmányok készültek, majd ezen elméletek, becslések igazolása kísérleti úton. Ezen tanulmányok és más publikációk vezettek az alábbi in vivo bőr károsodási tesztek megjelenéséhez: - Emberi bőr modell teszt. - Transzkután elektromos ellenállás teszt.

Kezdeti megfontolások Igazolt tanulmányok és más publikációk szerint a patkány bőrön végzett TER vizsgálat, során megbízható eredménnyel különbséget lehet tenni tényleges és nem valós bőrkárosodás között. Az ebben az Ajánlásban leírt teszt segít azonosítani a bőrkárosító anyagokat és oldatokat. Továbbá tájékoztatást ad a helyettesítő anyagokról és oldatokról. Ennek a teszt módszernek a stratégiája tartalmazza az in vitro bőrkorróziós tesztek és bőr irritációs vizsgálatok eredményeit, és ezek alapján tesz javaslatot élő állatokon történő vizsgálatokra.

A teszt elve A bőrlemezkék epidermális felületére visszük fel a vizsgálandó anyagot 24 órára. Két komponensű anyag esetén a bőrlemezkék elválaszó szerepet is játszanak. A felhasznált bőr egy hónapos humánusan megölt patkányoktól származott. A korrózív anyagok a normál szaruhártya elvékonyodását és fedő képesség elvesztését okozzák, mely a TER mérés során egy küszöbérték alá való csökkenéssel jár. Ez a levágási érték 5kΩ-ban lett megállapítva. Általában a nem-korrózív csak irritáló (vagy az sem) anyagoknál a teszt eredmények nem csökkenek 5kΩ alá. A módszer egy festési eljárást is magában foglal, a jó mérési értékek érdekében az 5kΩ-os értékek körül. Ez a festés határozza meg az ionos permeabilitást, mely emelkedhet a szaruhártya pusztulása miatt.

Az eljárás Az állatok A patkány a választott faj, a bőrük érzékenysége a vegyszerekre már sokat vizsgált. A koruk és a származásuk fontos az állatoknak, hogy biztosak legyünk benne, hogy a felnőtt kori szőrzetük még nem kezdődött el. A háti és két oldali szőrt óvatosan távolítják el egy kis pengével a hozzávetőleg 22 napos hím vagy nőstény patkányokról. Ezután a megtisztított bőrfelületet óvatosan mossák antibiotikumos oldattal (pl.: sztreptomicin, penicillin stb.). Az állatokat az első mosást követően 3-4 nappal újra megmossák, majd három napon belül fel is használják.

A bőrlemezek előkészítése Az állatokat napos korukban kell elaltatni. A bőröket lenyúzzák, és a bőr alatti zsírréteget gondosan eltávolítják. A bőrlemezek 20 mm-es négyzetekben távolítják el, majd tárolják ha szükséges. Minden egyes bőrlemezt PTFE csőbe teszik, úgy hogy a végeik fedjék egymást és az epidermisz érintkezzen a csővel (1. ábra). A cső végén gumi gyűrűvel rögzítik a bőrt., majd óvatosan lezárják vazelinnel. A csövet egy csattal rögzítjük a MgSO4 oldatos kamrában. A bőröknek teljesen el kell merülniük az oldatban. Egy állatról bőrlemezt lehet eltávolítan.i A teszt megkezdése előtt, minőség ellenőrző mérést kell végezni. Két bőrlemeznek mérjük az ellenállását (állatonként), ha 10kΩ alatti az eredmény a bőr ki kell dobni.

A teszt és vezérlőanyagok alkalmazása Egyidejű pozitív és negatív ellenőrző anyagokat kellene mindegyik tanulmánynál használni, hogy biztosított legyen a megfelelő kísérleti modell előállítása. Ugyanazon állat bőrlemezeit érdemes használni. A javasolt anyagok 10M-os HCL és desztillált víz, külön- külön. Folyékony teszt anyagokból 150μl-t viszünk fel egyenletesen az epidermisz felületre a csövön belül. Szilárd anyagok esetében finoman kell eloszlatni a bőrön, úgy hogy azt teljesen lefedje. Ioncserélt vizet csepegtetünk a szilárd felületre, és érdemes 30 fokra melegíteni az anyagot, a maximális érintkezés érdekében. Három bőrlemezt használunk mérésenként és egy ellenőrző anyagosat. A vizsgált anyagot 24 órára viszik fel a bőrre szobahőmérsékleten, majd 30 fokos csapvízzel teljesen lemossák.

A TER eljárás A impedanciáját alacsony feszültséggel mérik, Wheatstone hidat használva. A híd működési paraméterei: 1-3 V feszültség, Hz frekvencia, 0,1-30kΩ mérési tartomány. A híd állandói: indukció 2000H, kapacitás 2mF, ellenállás 2MΩ, frekvencia 100Hz vagy 1kHz, soros vagy párhuzamos értékeket használva. Az ellenállás mérés előtt, a bőr felületi feszültségének csökkentése érdekében megfelelő mennyiségű 70%-os etanollal borítjuk az epidermisz felületét. Az alkoholt pár másodperc múlva leöntik és a felületet 3ml MdSO4 oldattal hidratálják. Az elektródokat a bőr két oldalához helyezik és mérik az ellenállást kΩ/bőrlemez egységekben (2.ábra). Ha a mért ellenállás nagyobb mint 20kΩ, akkor anyagmaradványok vannak valószínűleg a vizsgált felületen, melyeket akár el is távolíthatunk. A tesztkészülék tulajdonságai és dimenziói hatással lehetnek az elért eredményekre. Az 5kΩ-os küszöbérték az Ajánlásban leírtak szerint lett meghatározva. Más mérési paraméterek és feltételek mellett más küszöbértéket kapunk. Ezért fontos a készülék megfelelő kalibrálása és a megfelelő referencia minták kiválasztása (1. táblázat).

Festési Eljárások A TER vizsgálat után a MgSO4-ot eltávolítjuk, és a bőrön gondosan megvizsgáljuk a látható sérüléseket. Ha nincsenek számottevő sérülések, akkor az alábbi oldattal vonjuk be a felületet 2 órára: 150μl 10 v/v %-os sulforhodamine B desztillált víz, majd csapvízzel mossuk. Ezután a bőrlemezeket óvatosan eltávolítjuk a csőről, és egy üvegcsébe rakjuk melyben 8ml ioncserélt vizet tettünk. Az üveget 5 percig rázatjuk, hogy az összes maradék festék kioldódjon. Majd 30 %-os SDS oldatba tesszük a lemezeket és újra rázatjuk 5 percig és 60 fokon inkubáljuk. Az inkubáció után, kivesszük leöntjük és a maradék oldatt centrifugálással távolítjuk el (8 perc, 21 fok). 1 ml mintát higítunk 1:5 arányban SDS oldattal. Az optimális sűrűséget (OS) 565nm-en mérjük. A festéktartalom számítása: a sulforhodamine B tartalmat az OS értékből számítjuk. Az anyag törésmutatója 565nm-en 8,7*10^4, molekulatömege: 580. A festék tartalmat minden egyes bőrlemezhez egy megfelelő kalibrációs görbéből meghatározható, majd durván kiszámolható.

Eredmények értékelése A durva Ter teszt eredmények elfogathatók, ha pozitív és negatív kontrol értékek beleesnek a módszer elfogadási tartományába. A festési eredmények szintén elfogadhatók, ha beleesnek az alábbi tartományokba: A tesztelt anyag bőrkárosítónak tekinthető amennyiben: a TER értéke kisebb vagy egyenlő 5kΩ, és vannak látható sérülések Vagy, nincsennek látható sérülések, de a lemez festék tartalma nagyobb vagy egyenlő a sósavval mért érték. Anyag neveElfogadási határ(kΩ) Pozitív10 M-os HCL0,5 – 1,0 NegatívDesztillált víz Anyag neveFesték tartalom (μg/lemez) Pozitív10 M-os HCL40 – 100 NegatívDesztillált víz

Adatok és a beszámoló A teszt beszámolójának az alábbi információkat kell tartalmaznia: A tesztelt és kontroll anyagokra vonatkozóan: vegyszer neve (UIPAC, CAS), tisztaság és összetélel (%), fiz-kém jellemzők : fázis, PH, stabilitás, oldhatóság….. az anyagok kezelése a teszt előtt, A résztvevő állatokról: származásuk és nemük, életkoruk a felhasználáskor, beszerzési hely, tartási feltételek, étrend…… a bőrük előkészítésének részletei, Méeési körülmények: a készülék kalibrációs görbéi a festés kalibrációs görbéi

a TER mérés részletes ismertetése a festési eljárás részletei a mérés bármely módosítása értékelési ismertetőjelek leírása Eredmények: TER és a festés adatainak tabulálása egy állathoz tartozó bőrmintákra megfigyelt változások, hatások leírása Az Eredmények értékelése. Levont következtetések.

1. Táblázat

1. Ábra

2. Ábra