In vitro Bőr roncsolódási teszt vegyi anyagokra Emberi bőr modell teszt (OECD 431) In vitro Bőr roncsolódási teszt vegyi anyagokra A vázlatot készítette: Névery Dorottya; 2011. április

Teszt típusok In vivo In vitro „in vivo” = élőben Élő szervezet(ek)en végzett vizsgálat Általában állatkísérleteket jelent „in vitro” = üvegben Izolált szerv(ek)en, sejt- vagy szövettenyészet(ek)en vagy biokémiai rendszereken végzett laboratóriumi vizsgálat

Az in vitro bőr roncsolódás tesztek alkalmazhatósága A validálási eljárás vizsgálati eredményei alapján ezek a tesztek kellő megbízhatósággal különítik el a roncsoló és a nem roncsoló anyagokat (és bár a roncsoló tulajdonság mértékéről is tájékoztatnak, a további kategorizálás mégsem megengedett!); A roncsolási vizsgálatok adatai nem alkalmasak a bőrirritáció megítélésére! Nagy előny, hogy nem kell (szenvedő) állatokon kísérletezni…

A bőr visszafordíthatatlan károsodása. Bőr roncsolódás A bőr visszafordíthatatlan károsodása. Roncsoló az az anyag, amely a bőrrel érintkezve 4 órán belül látható szövetkárosodást vagy szövetelhalást okoz a felhámon keresztül az irhában is. (fekélyek, vérzések, gennyes sebek, hegek, színelváltozás stb.)

Az emberi bőr modell teszt alapelve A tesztben egy háromdimenziós emberi bőr modellt alkalmaznak. A vizsgálat abból a feltételezésből indul ki, hogy a roncsoló anyagok a szarurétegen diffúzióval vagy kimarással (erózióval) képesek áthatolni és a mélyebb rétegekben cytotxikus hatást fejtenek ki.

Emberi bőr modell A modell előállítható a tesztelő laboratóriumban vagy kereskedelmi úton is hozzá lehet jutni (pl. EpiDerm™, EpiSkin™ modellek) Az emberi bőr modell alkalmazásánál is figyelembe kell venni a nemzeti és nemzetközi etikai egyezményeket és megállapodásokat.

BŐRSZÖVET KITENYÉSZTÉSE

A modell általános jellemzői Emberi keratin sejteket használnak a bőrszövet mesterséges (laboratóriumi körülmények között történő) felépítéséhez. A szaruréteg alatt életképes bőrszövetnek kell jelen lennie. A szaruréteget a szükséges lipidekkel megvastagítják, hogy megakadályozzák a cytotoxikus markerek túlságosan gyors behatolását (az expozíciós idő és a kontroll minta ET50 értékének ismeretében becsléssel állapítják meg a szükséges vastagságot). A modellt óvni kell a szennyeződésektől és használat előtt meg kell róla győződni, hogy nem került rá baktérium vagy gomba.

Gyakorlati feltételek A sejtek életképességének ellenőrzésére a mintákat (mérésenként legalább két szövettenyészet ) megfestik és az optikai sűrűséget megmérik. A negatív kontroll (pl. vízzel vagy 0,9%-os NaCl-al kezelt) szövetnek a teszt teljes időtartama alatt stabilnak kell lennie (reprodukálhatóság!) Minden esetben referencia anyaggal* ellenőrzik a modell helyességét. * Pl. propánsav – erősen roncsoló; 10%-os KOH – roncsoló; eugenol – nem roncsoló

A teszt szövet alkalmazása Folyékony anyagok vizsgálatánál a bőrfelületet egyenletesen el kell fedni (min. 25 µl/cm3 ajánlott) A szilárd anyagokat aprítás (+előkezelés) után ioncserélt vagy desztillált vízzel nedvesítik, hogy a bőrrel való megfelelő érintkezést biztosítsák. A mérés előtt alaposan leöblítik a bőrszövet felszínét (pl. 0,9%-os NaCl-al)

A sejtek életképességének mérése Leggyakrabban MTT-t (Thiazolyl kéket) használnak. A bőrszövetet MTT oldatba (0,3 – 1 mg/ml) merítik, majd 3 órán keresztül inkubátorban szárítják. A visszamaradt kék formazan csapadékot izopropanollal extrahálják, majd 540 és 595 közötti hullámhosszon megmérve az optikai sűrűséget (OD-t), meghatározzák a formazan koncentrációját.

Hibás eredmény A tesztelt anyag és a festék közti kémiai reakció hamis eredményekhez vezethet. Ez olyankor történhet meg, ha nem megfelelően öblítették le a mérés előtt a szövetet, így az anyag egy része ott maradt. Ilyenkor a mérést meg kell ismételni. Ezért kell több párhuzamos szövetmintával is elvégezni a vizsgálatot.

Az eredmények kiértékelése A negatív minta OD értékeit 100%-nak véve a kapott adatokból kiszámítható a relatív életképesség aránya. A teszt eredményének kiértékelése során alkalmazott statisztikai módszereket minden esetben világosan definiálni és dokumentálni kell. Az eredményeket táblázatos formában kell megadni.(OD; %-os életképesség a tesztanyagra, ill. a pozitív&negatív kontrollra – átlagos és egyedi értékek is!)

Pl. az EpiDerm™ modellre: Bőrroncsolónak tekinthető az az anyag, amiben 3 perces kitettség után az életképesség 50% alá csökken vagy 3 perces kitettségnél még 50% vagy annál nagyobb az életképesség, de 1 óra után 15% alá csökken Nem roncsolónak tekinthető az az anyag, amiben 3 perces kitettség után az életképesség 50% vagy annál nagyobb és 1 órás expozíció után még mindig 15%-os vagy annál nagyobb érték mérhető

A jegyzőkönyv tartalma Teszt és kontroll anyagok azonosítója (CAS száma / IUPAC neve) Az anyagok tisztasága (tömeg%) Fizikai-kémiai tulajdonságok (fizikai állapot, pH, stabilitás, oldhatóság stb.) Az előkezelés műveletei (melegítés, őrlés stb.) A tenyészetek stabilitása (ha ismert) Az adott eljárás és bőr modell alkalmazásának indoklása A teszt körülményei (kalibrálási információk, a használt berendezések adatai stb.) Az eljárás részletei (pl. adagolt dózisok) Bármilyen eltérés a szokásos eljárási rendtől Az eredmények táblázata minden egyéb megfigyeléssel Az eredmények értékelése Következtetések, összefoglalás

Összefoglalás Számos tanulmány, vizsgálat, laboratóriumok közti összemérés eredményeként ma már megbízható tesztek vannak az állatkísérletek kiváltására. Ennek ellenére több szervezet (pl. ICCVAM, FDA, CPSC) még mindig ragaszkodik az in vivo „ellenőrzésekhez” is… Az in vitro tesztek az anyagok bőr roncsoló hatását emberi eredetű szövettenyészeteken vizsgálják.

Felhasznált irodalom Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guideline for the testing of chemicals No. 431. In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test www.peta.org/issues/animals-used-for-experimentation/skin-corrosion.aspx www.alttox.org/ttrc/toxicity-tests/skin-irritation/