immunostimulator peptides; muramyl dipeptide tuftsin derivatives Immune peptides: synthetic antigens; vaccines diagnostic tools immunostimulator peptides; muramyl dipeptide tuftsin derivatives Hormones: oxytocin vasopressin insulin somatostatin GnRH etc. Neuropeptides: substance P cholecystokinin neurotensin Antibiotics: tachikinin gramicidine S Transporter peptides: penetratin oligoarginine HIV-Tat protein Applications of synthetic peptides Toxins: conotoxins spider toxins snake toxins ionchanel blockers Carriers: templates miniproteins Peptides for structural studies: turn mimicking cyclic peptides Enzymes and enzyme inhibitors: Ribonuclease A

Why chemists are needed? Gene expression is very popular, relatively easy and cheap method: it is good for long linear peptides or proteins containing L-amino acids. However: no D-amino acids no unnatural amino acids no post translation (Hyp, Pyr, glyco- and phosphopeptides) no branches no cyclic peptides no fluorescent or isotop labeling Peptides as drugs: there are not too many, because of the price and their fast biodegradation. “Peptides have and will continue to be important sources of lead compounds in many drug discovery programs. However, due to their generally poor pharmacokinetic properties and hydrolytic instability, natural peptide structures are usually substituted with mimics of the actual peptide constuction.”

Peptidek mint gyógyszerek ? A peptidekhez, fehérjékhez számos biológiai és élettani funkció kapcsolható. Ezért a '60-as évektől a jövő gyógyszereinek gondolták. Előnyök: nagy specifitás, magas aktivitás, viszonylag kis dózis, kicsi toxicitás, kevés mellékhatás. Hátrány: gyors lebomlás, magas költségek. 2000-ben a világ gyógyszeriparának kb. 265 milliárd USD bevételéből 28 milliárd USD a peptidek és fehérjék bevételéből származott. Évente 35-40 új vegyület kerül gyógyszerként bevezetésre. Ezek között a peptidek száma egyre növekszik.

Peptidek a piacon piacon pre-regisztrációs fázis klinika-II Rekombináns fehérjék: >50 ~40 ~60 Monoklonális ellenanyagok: >20 >20 >45 Szintetikus peptidek: >40 >20 >60 piacon pre-regisztrációs fázis klinika-II klinika-III GnRH szuper-agonisták és antagonisták: tumor terápia Szomatosztatin analógok: tumor terápia ACE (angiotenzin konvertáló enzim) inhibitorok: vérnyomás szabályozás HIV proteáz inhibítorok: AIDS ellen Vazopresszin, Oxitocin, ACTH: hormonok Kalcitoninok: oszteoporózis ellen Immunstimuláló peptidek: szervezet védekező képességének növelése A. Loffet J. Peptide Science (2002) 8, 1-7.

TÖRTÉNETI IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. E. Fischer: Berichte 39, 530 (1906) Peptidek, polipeptidek fogalma, elmélete, szintézise 2. J.S. Fruton: Advances in Protein Chemistry Vol.5. (Academic Press, New York 1949) Felöleli az addigi peptidkémiát. 3. J.P. Greenstein, M. Winitz: Chemistry of Amino Acids (J. Wiley, New York, 1961) Lexikális gyüjtemény aminosav- és kismolekulatömegû peptidszármazékokról. 4. E. Schröder, K. Lübke: The Peptides I-II. (Academic Press, New York 1965-1966) Peptidkémikusok bibliája. 5. M. Bodánszky, M.A. Ondetti: Peptide Synthesis (J. Wiley and Sons, New York, 1966) 6. Medzichradszky Kálmán: A természetes peptidek szintézise. A kémia újabb eredményei 3 (1970) 7. Bajusz Sándor: Peptidszintézis. A kémia újabb eredményei 47 (1980) 8. R.B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) Szilárdfázisú peptidszintézis elve 9. J.M. Stewart, J.D. Young: Solid phase peptide synthesis (Freeman and Co., San Francisco, 1969), (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) Boc-technika 10. E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989) Fmoc-technika 11. G.A. Grant: Synthetic peptides, a user´s guide (Freeman and Co., New York, 1992)

PEPTID SZINTÉZIS Aminosavak kapcsolása: NH2-CH(R)-COOH + NH2-CH(R’)-COOH - H2O NH2-CH(R)-CO-NH-CH(R’)-COOH; NH2-CH(R’)-CO-NH-CH(R)-COOH; NH2-CH(R)-CO-NH-CH(R)-COOH; NH2-CH(R’)-CO-NH-CH(R’)-COOH; + oligomerek és polimerek különböző összetételben Védőcsoportok: amino-; karboxil-; oldallánc védőcsoportok X-NH-CH(R)-COOH + NH2-CH(R’)-COOY - H2O X-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R’)-COOY; Védőcsoportok eltávolítása együtt vagy szelektíven

Oldatfázisú és szilárdfázisú peptidszintetikus eljárások TÁRGYALT TÉMAKÖRÖK Oldatfázisú és szilárdfázisú peptidszintetikus eljárások Z NH CH C O OX + H 2 N OY R 1 - HOX amino védőcsoportok oldallánc védőcsoportok karboxil védőcsoportok (szilárdfázisú szintézisnél gyanta tölti be ezt a szerepet) karboxilcsoport aktiválás kapcsolási eljárások védőcsoportok hasítása

AMINOSAVAK Monoamino-monokarbonsavak: CH R H N COOH Gly (G): Ala (A): 2 N COOH Monoamino-monokarbonsavak: Gly (G): Ala (A): Val (V): Leu (L): Ile (I): Nle : Phe (F): Pro (P): 3 * C NH nem csak R Trp (W): Ser (S): Thr (T): Tyr (Y): Cys (C): Hcy : Met (M): Hyp : OH SH S HO

Monoamino-dikarbonsavak (savas): Asp (D): Glu (E): CH 2 COOH Asn (N): Gln (Q): CONH (pK: 2,98) (pK: 3,22) (pK: 5,41) (pK: 5,65)

AMINOSAVAK ELŐFORDULÁSA ÉS SZINTÉZISE Bruckner Győző: Szerves kémia I/2 -ketokarbonsav -iminosav -aminosav (R=CH3, piroszőlősav (alanin) Racém termék rezolválás - N-acetil származék enzimes hidrolízise: L-konfigurációjú hasad, D nem - N-védett származék brucin sójának szétkristályosítása

Megoldás: Gly-NH2 kiindulás, hidrolízis nem dipeptid fázisban Az aminosavak rövid bemutatása Glicin (G): nincs aszimmetria centrum nincs racemizáció nincs oldallánc könnyű reakcióba vinni mellékreakciók nagy flexibilitás konformációs változatosság Megoldás: Gly-NH2 kiindulás, hidrolízis nem dipeptid fázisban (Z-Aaa-Gly-Gly-OR´) ! 1.

-C atomon nincs térgátlás - önacilezés NH CH H 2 C COOH CO N O 1 2. Szukcinimid gyűrűzárás: Asp(OR)-Gly, Asn-Gly ~30% ~70% Z (Z-Gly) 3. Diacetileződés: a -C atomon nincs térgátlás - önacilezés 4. Diketopiperazin képződés: Gly-Pro, Gly-Gly

Alanin (A): aszimmetria centrum racemizáció (kis mértékű) gyors reakció, nincs nagy térgátlás sok Ala apoláros karakter oldékonyság csökkenés Valin (V): aC-atomon izopropilcsoport térgátlás lassú reakciók mellékreakciók fokozódása — Z-Val-OH > Boc-Val-OH, H-Val-OtBu > H-Val-OEt — karboxilcsoport reaktivitását jobban gátolja, mint az aminocsoportét — aminosav analízis 48 óra 1 R C O N 3 - 2 H N-R NH 1. Azidos kapcsolás: azid izocianát-származék karbamid-származék

Gyenge nukleofilek (pl. o,p-nitrofenol) esetén ! 2. O N acilvándorlás (migráció) Gyenge nukleofilek (pl. o,p-nitrofenol) esetén ! Piridin oldószer növeli a nukleofilitást. R C O CH NH HN N 3. Savkloridos kapcsolás: X-Val-Cl + NH2-R + OH- X-Val-OH + NH2-R + Cl- 4. Észter hidrolízis, hidrazinolízis: X-Val-OMe + NH2-NH2 (NaOH) lassú racemizáció 5. Acilezés Tyr jelenlétében: Tyr OH-csoportja is acileződhet

+ 6. Vegyes anhidrides kapcsolás: Z CH 2 C O H 3 + N-R NH R Z-Val-OH + klórszénsav izobutil észter vegyes anhidridje 5-8% fordítottan acilezett származék normális esetben <1% Izoleucin (I): a valinra leírtak fokozottan igazak, még egy aszimmetria centrum alloizoleucin Norleucin (Nle): nor egyenes lánc, metionin helyettesítése peptidekben Leucin (L): az alaninhoz hasonló, de nagyobb oldallánc (térgátlás) lassabb reakciók Fenilalanin (F): benzilcsoport az oldalláncban — katalitikus hidrogénezés benzolgyűrű telítődése — hosszú hidrogénezést kerülni kell ( His(Bzl), Arg(NO2) ) — Z-Phe-O- Na+ Op.: 133-134°C, Z-Phe-OH Op.: 88-89°C megfelelően végzett savanyítással elkerülhető (Z-Gly-OH, Z-Ala-OH, Z-Lys(Z)-OH, Z-Val-OH, Z-Ser-OH)

Prolin (P): iminosav, nem racemizálódik, merev struktúrában törés -turn szerkezetben 1. Prolin körüli kötések labilitása: Z-Pro-Gly-OMe + 1M NaOH Z-Pro-OH (0,1M NaOH jó) Tyr-Pro, Thr-Pro, Ser-Pro, Lys-Pro (Na/NH3) közeli proton katalizálja a hasadást Asp-Pro híg savakra hasad 2. Diketopiperazin képződés: lásd Gly Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Pro, D-Aaa és nagy oldallánc elősegíti SPPS (szilárdfázisú peptidszintézis), aktivált származékok tárolása

3. Szekunder amin alkileződése: könnyebben N-alkileződik, mint a primer amin SPPS lánc letörés: 4. DCC-s kapcsolás: O N acilvándorlás DMF > DCM

Triptofán (W): savas, oxidatív rendszereket nem bírja fémionok, napfény katalizál kinoidális átrendeződés 1. Aminosav analízis: enzimes hasítás, vagy metánszulfonsavas hidrolízis Tyr:Trp (UV meghatározás) Tyr (aminosav analízis) 2. Indolgyűrű alkileződése: terc-butil kation (különösen veszélyes) HF hasítás előtt Boc-csoport eltávolítása! Irreverzibilis gyökfogók (scavanger) 3. Azidos kapcsolás: R-NH2NH2 +HNO2 közben az indolgyűrű nitrozálódhat

4. UV hatása hidrolízis közben: 5. N-terminális Trp viselkedése fragmenskondenzáció során:

Metionin (M): oxidáció, alkileződés 1. Oxidáció: savas közegben levegő hatására szulfoxid keletkezik. erős oxidálószer (pl. H2O2) hatására szulfon keletkezik 2. Alkileződés: — tioanizol gyökfogó alkalmazása szükséges (hard-soft, pull-push) — ha benzil kation megy rá, metil fog lehasadni, S-benzil-homo-cisztein keletkezése közben 3. Katalizátor méreg: S atom miatt (cisztein is) BF3 adalék segít vagy pótolni a katalizátort

Szerin (S): hidrofil OH-csoport funkciós csoport alternatív védelem (SPPS!) 1. OH acileződése: acilezőszer nagy feleslege esetén NH > OH nukleofilitás 2. Acilvándorlás: Gly-Ser N O, O N fenolok gátolják, HOBt, imidazol segíti az acilezôdést 3. Intramolekulris acilezés: ez általában nem gond, mert tovább acilez 4. Curtius átrendeződés:

5. Leuchs anhidrid: az OH-csoportot védeni kell 6. SPPS: HF hasítás N O migráció láncszakadás 7. Szerin észterek lúgos hidrolízis dehidroalanin (Thr vízvisszavétel racemizáció allotreonin)

Treonin (T): aC--bC két aszimmetria centrum treo Thr Na sója nem oldódik alkoholban, az allotreoniné igen. Szerinhez hasonló viselkedés, de térgátlás miatt lassabb reakciók. Tirozin (Y): vízben oldódik a fenolos OH miatt (lúgos kirázás!) 1. Alkileződés: OH segíti a gyűrű alkileződését (Bzl védelem intramolekuláris alkileződés) 2. Acileződés: Tyr » Ser > Thr ( Z-Cl Z-Tyr(Z)-OH ) átacilezés is könnyebb O N migráció 3. Azidképzés: NaNO2 gyűrű nitrozálódása 4. OH nukleofilitása összehasonlítható az NH-éval hosszú reakció vagy acilezőszer felesleg O-acilezés de bázissal bontható

Cisztein (C): cisztein ---- cisztin (oxidáció) 1. Könnyen oxidálódik, pH≈7, levegô jelenlétében. Redukálása merkapto vegyületekkel (DTT, merkaptoetanol) 2. Oxidatív hasítás ciszteinsav (pl. aminosav analízis) 3. Acilezésben versenyez az NH-csoporttal, N S migráció pl. Npys-csoport 4. Alkileződés: védőcsoportok hasításánál (gyökfogók használata) 5. Katalizátor méreg, H2/kat. 6. Diszproporcionálódás: aszimmetrikus diszulfidhidak szimmetrikussá alakulása.

Aszparagin (N), Glutamin (Q): oldallánc amid (CONH2) 1. Dehidratáció: karboxamid-csoport vízvesztéssel nitrillé alakul ( ). DCC, foszgén, Tos-Cl/piridin, POCl3 Asn és Gln kapcsolása aktív észteres vagy in situ aktív észteres eljárással. Beépült Asn, Gln már nem módosul. 2. Gyűrűzárás: Asn: szukcinimidgyűrű (ezt követő transzpeptidáció), ld. Gly. Gln esetén a megfelelő glutárimid kialakulása ritka. Gln: piroglutaminsav képződés a peptid N-terminálisán. Gln > Glu(OX) > Glu, HCl/ecetsav > HCl/dioxán, TFA/DCM Közeli His, Lys, Arg katalizál! Savas körülmény és magasabb hőmérséklet segíti! Asn esetén a négytagú gyűrű miatt nem alakul ki.

Aszparaginsav (D), Glutaminsav (E): Oldallánc karboxilcsoportot védeni kell! E nélkül az aktiválás ciklikus anhidridhez vezet ( és -peptidkötés alakul ki). Oldalláncban védett Asp és Glu hasonló gyűrűzárási mellékreakciót mutatnak, mint az Asn és Gln, bár kisebb mértékben (védőcsporttól függő). Hisztidin (H): alkil- és acilátvivő tulajdonsága okoz sok gondot. Nincs igazán jó védőcsoportja (ld. védőcsoportoknál). Lizin (K): Oldallánc eNH2-csoport védelme elengedhetetlen. Arginin (R): Arg Orn átalakulás bizonyos védőcsoportok hasításánál. Szulfonsav-típusú védőcsoportjainak hasításakor inkább más aminosavak (pl . Tyr sérül).

Amino védőcsoportok (X): nem uretán típusúak, uretán típusúak Acetil, trifluoracetil tozil, stb. Z, Boc, Fmoc

Racemizáció H R N C R’ O ActO C:- O:- DL és LL dipeptid származékok B: Acil-L-Aaa-OAct B: -ActOH 5(4H)-oxazolon -H+ C:- O:- Pszeudo aromás rendszer +H+ DL H-L-Aaa-OY DL és LL dipeptid származékok Direkt proton elvonás vagy oxazolon képződés; Nincs racemizáció: Gly és Pro (oxazolonon keresztül); Nincs racemizáció:uretán típusú védő- csoportok használatakor (Boc, Fmoc); N a fő nukleofil His: proton transzfer

Nem uretán típusú NH védőcsoportok Tozil (Tos): Du Vigneud Bevitel: Tos-Cl formában Racemizáció: Tos-Aaa-OH kapcsolásakor nincs, S a fő nukleofil Hasítás: Na/NH3 redukció ( Cys(Bzl), His(Bzl) ) Problémák: Lys-Pro, Thr-Pro kötés hasadása Arg(Tos) Orn Orn(Tos) laktámgyűrű (Lys(Tos) kevésbé) Elektrolitikus redukció: Pb- (Tos-Peptid, 20%MeOH, pH≈11), C+ (20% HCl) Erős sav: HF, TFMSA

Kapcsolás: nem kapcsolható vegyes anhidrides módszerrel, mert jelentős mennyiségben fordítottan acilezett termék. Savkloriddal csak MgO szuszpenzióban (azidoknál hasonlóan): Aktív észteres kapcsolás: (Pro és pGlu kivételével)

Ftalil (Pht): Bevitel: ftálsavanhidrid + Aaa (Gly esetén ömlesztés 150°C) Nem alkalmazható módszer: Trp, Asn, Gln, Met, Asp-Pro!

Nefkens: Hasítás: hidrazinolízis (bár ez sem kvantitatív)

Formil (For): vízoldékonnyá teszi a peptidet (ioncserés tisztítás) Bevitel: hangyasav + ecetsavanhidrid + Aaa, For-OTcp Hasítás: hidrogén-peroxid Cys, Trp, Met oxidálódik! 0,5M HCl (alkohol-víz elegy) melegítve Gly-Lys(For) kötéshasadás Hidrazin vagy hidroxilamin (enyhén savas közegben) Rezisztens: HBr/jégecet, híg lúg, Na/NH3

Trifluoracetil (Tfa): Lys(Tfa) Bevitel: Tfa-anhidrid (felesleg racemizáció) Tfa-anhidrid/TFA ( Tfa-Lys-OH ) Tfa-OEt ( H-Lys(Tfa)-OH ) Tfa-OPh, CF3-CO-CCl3 Hasítás: híg NaOH, Ba(OH)2, NaBH4 redukció HCl/EtOH Tfa-OEt + peptid-észter HCl-sója (más savakkal szemben stabil) Tfa-peptid-észter magas gőztenzió gázkromatográfia 19F NMR

Klóracetil (ClAc): szelektív hasíthatóság, ciklizálás Bevitel: klórecetsav-anhidrid, ClAc-OPcp Hasítás: tiovegyületekkel 1. 2-merkapto-3-nitro-piridin 2. 1-piperidin-tiokarboxamid Racemizáció: utólagos bevitel

Ciklizálás: klóracetilezett aminocsoport + Cys SH-csoportja Konjugálás: BrAc-származék jobb (de nem szelektív) Fehérje vagy polipeptid NH-csoportjainak módosítása BrAc-csoporttal és ezt reagáltatni Cys tartalmú peptiddel.

Alkil-típusú védőcsoportok: Hasítás: savas hasítás, savérzékenység: Mmt>Mtt>Trt»Bha»Bzl Mmt és Mtt 1% TFA/DCM, Trt 5% TFA/DCM Bzl inkább H2/kat Savlabilitás fokozása: metoxi > metil Savstabilitás fokozása: nitro > klór Alkalmazásuk a nagy térgátlás miatt főleg oldallánc védelem. Racemizáció: Bzl - racemizálódik, Trt-Aaa-OX térgátlás miatt nem.

Arilszulfenil védőcsoportok: Hasítás: 1. savas (HCl/éter, EtOAc, MeOH) (NPS) 2. nukleofil: tiovegyületek (NPS, Npys) Cl és OMe szubsztituált NPS származékok a savstabilitás változtatása érdekében. Trp indolrésze , ill. Tyr szubsztituálódhat. N S átmenet Cys esetében, HOBt, His katalizálja. Racemizáció: van

1-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciklohexililidén)-etil (Dde): Hasítás: Speciális hasíthatóság miatt fôleg oldallánc védelem. 2% hidrazin/DMF 2x3 perc Rezisztens: TFA hatására 0,1% hasad 20% piperidin 3% hasad 2 óra alatt 6,5% hasad 4 óra alatt. metil helyett izopropil (ivDde) csoport növeli a védőcsoport stabilitását piperidinben

URETÁN TÍPUSÚ VÉDŐCSOPORTOK Aktivált aminosavszármazék nem racemizálódik. Nagy variációs lehetőség (különböző hasítások). Kiszorították a nem uretán típusú védőcsoportokat, elsősorban az -aminocsoportok védelmében. Benzil-oxi-karbonil (Z): Bevitel: Z-Cl (klórhangyasav benzilészter: C6H5-CH2-O-CO-Cl) foszgén + benzilalkohol (foszgén feleslegben) Z-Cl Termikus bomlással CO2-t veszthet + C6H5-CH2-Cl Nem tisztítják desztillálással (esetleg vacuum desztillálás)! Hasítás: 1. H2/kat. (Pd/C) (Cys, Met +TEA karbamilát+ CO2) Z-PEPTID C6H5-CH3 + HO-CO-NH-R CO2+ NH2-R Nincs térfogatváltozás! H2 CO2 (Ba(OH)2 BaCO3 követés)

2. Savas hasítás: HBr/jégecet, HF, TFMSA, TMSOTf (TFA/DCM (≈1%)) HBr/THF v. dioxán éterkötés hasadás észterezés 2N HCl/hangyasav (Met) alkileződés visszaszorítása 3. Na/NH3: ritkán használják, iparban

Problémák: 1. Z-védőcsoport nem érzékeny bázisra, de 2. Savklorid képzés: Tionil-klorid helyett PCl5 a savklorid kialakításához. 3. Savas hasítás: Bzl-észter is hasad a Z-csoport hasításakor < 20 perc és < 20°C ≈ szelektív Z-csoport hasítás

Szubsztituált származékok:

terc-butil-oxi-karbonil (Boc): Bevitel: Boc-N3, di-terc-butil-dikarbonát ( (Boc)2O ) Hasítás: híg savakra; 25% TFA/DCM, 2N HCl/dioxán, EtOAc hangyasav, 0,1N HCl/hangyasav Stabil: H2/kat. bázis, hidrazin, Na/NH3 Probléma: tBu kation alkilezi a Trp,Met, védett Cys aminosavakat

Származékok:

9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc): Bevitel: Fmoc-Cl, Fmoc-OSu

Hasítás: gyenge szerves bázisok (szekunder aminok); piperidin, morfolin, DEA (dietil-amin), DBU: 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én TBAF: tetra-butil-ammonium fluorid Rezisztens savakra, H2/kat. (ellenvélemények is) Probléma: Hosszú hasítás esetén diketopiperazin képződés a kritikus szekvenciáknál. A keletkező dibenzofulvén okozhat mellékreakciókat. Allil-oxi-karbonil (Aloc): Bevitel: Aloc-Cl Hasítás: Pd(O)/(Ph)3P Rezisztens: sav, bázis (szelektív, ortogonális) védőcsoport kombináció.

Ciklohexil-oxi-karbonil (Choc, Hoc): Bevitel: Choc-Cl, Choc-OSu Hasítás: HF, TMSOTf (25°C), 0°C-on 1-2%

Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl Z-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl PÉLDÁK 1. Tuftsin-származékok szintézise: Thr-Lys-Pro-Arg Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl Z-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl 1. HCl/EtOAc 1. HCl/EtOc 2. Boc-Thr-OPcp 2. Boc-Thr-OPcp Boc-Thr-Lys(Z)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl Z-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl 1. HCl/EtOAc 1. HCl/EtOAc H2/kat 2. H2/kat 2. For-OTcp u.a 3. H2/kat 1 2 3 4 5 6 1. Thr-Lys-Pro-Arg 4. Lys(Thr)-Pro-Arg 2. For-Thr-Lys-Pro-Arg 5. Lys(For-Thr)-Pro-Arg 3. Boc-Thr-Lys-Pro-Arg 6. Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg

7. Thr-Lys(Thr)-Pro-Arg 8. For-Thr-Lys(For-Thr)-Pro-Arg Boc-Lys(Boc)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl 1. HCl/EtOAc 2. Boc-Thr-OPcp Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(NO2)-ONBzl 1. HCl/EtOAc 1. HCl/EtOAc H2/kat 2. H2/kat 2. For-OTcp 3. H2/kat 7 8 9 7. Thr-Lys(Thr)-Pro-Arg 8. For-Thr-Lys(For-Thr)-Pro-Arg 9. Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg

Choc-Lys(Z-Gly)-Gly-R 2. Choc-Lys(Boc)-Gly-R 1. 33% TFA/DCM 2. 10% DIEA/DCM 3. Z-Gly-OH + DCC +HOBt Choc-Lys(Z-Gly)-Gly-R 1M TMSOTf-tioanizol/TFA 2. Choc-Lys(Boc)-Gly-R Choc-Lys(H-Gly)-Gly-OH BOP-HOBt-DIEA (3:3:6) Choc-Lys( Gly)-Gly H-Lys( Gly)-Gly HF-p-krezol (9:1)

3. Template Assembled Synthetic Protein (TASP): (Mutter et al.) Fmoc szintézis: 4. Lysine-tree (lizin fa), Multiple Antigen Protein (MAP): (Tam et al.) Szelektív hasítás után két különbözô epitóp kapcsolható (esetleg további módosítás után pl. klór-acetilezés).

KARBOXIL VÉDŐCSOPORTOK - észterek (kevesebb fajta) - olcsó, veszélytelenebb Szintézisek oldatban: X és Y is lehet észter. Minden észter aktiválás, de... OtBu < OEt < OBzl < OMe < OAll < OPh < ONp < OPcp < OPfp Szilárdfázisú szintézis: C-terminális karboxil védelem = gyanta

Metil-, etil-észter (OMe, OEt): Észter képzés: Aaa + alkohol (vízmentes) + HCl (gáz) Met, Trp, Tyr: kíméletesebb módszer tionilkloriddal Aaa alkoholos szuszpenzió + fölös tionilklorid: Az észter HCl sója éterrel kicsapható. Hasítás: enyhe alkalikus közeg; 0,1-1,5N NaOH-aceton (≈1:1) < RT, minimális bázis felesleg, < 1 óra Problémák: racemizáció (magasabb hőmérséklet, bázis felesleg, hosszú idő) NH3 vesztés (Gln, Asn) előfordulhat ciklizáció urea hidantoin Pht védőcsoport gyűrű felnyílása miatt nem! Ammonolízis: peptid-amid Hidrazinolízis: peptid-hidrazid peptid-azid

Benzil-észter (OBzl): Észteresítés: HCl katalízis nem jó, mert Bzl-Cl Bzl-Aaa (aminosav függő) p-toluol-szulfonátos katalízis (Fp csökkenés) azeotropos desztilláció (kristályvíz!) Hasítás: erős savak; HF, TFMSA, TMSOTf 2N HBr/jégecet (hosszabb idő, magasabb hőmérséklet) H2/kat. (PdC); nincs CO2 fejlődés H2 fogyás mérhető (alkoholban (ekv. HCl) vagy ecetsavban)

Szubsztituált benzil-észterek: p-nitro-benzil-észter (ONBzl): Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-nitro-benzil-alkohol Hasítás: H2/kat. (Pd/C), (HBr/jégecetre rezisztens) p-klór-benzil-észter (OClBzl): savstabilitást növeli Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-klór-benzil-alkohol Hasítás: erôs savakra; HF, TFMSA p-metoxi-benzil-észter: savlabilitás növelése Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + p-metoxi-benzil-alkohol Hasítás: gyenge savakra; TFA benzhidril-észter (OBh): Bevitel: X-Aaa-O- Ag+ + benzil-klorid Hasítás: sokféle; H2/kat. (Pd/C), TFA, bázis, hidrazin 2,2-dinitro-benzhidril-észter: Hasítás: fotolitikus hasítás

Ciklo-alkil-észterek (pentil, hexil, heptil) (OcPen, OcHex, OcHep): Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + megfelelő alkohol Hasítás: erős savak; HF (ciklopentil kicsit savérzékenyebb, míg a cikloheptil kissé bázis érzékeny, ciklohexil a legjobb) Allil-észter (OAll): Hasítás: Pd(0) hasítható, savra, bázisra rezisztens 9-Fluorenil-metil-észter (OFm): Bevitel: X-Aaa-OH + DCC + 9-fluorenil-metanol Hasítás: mint az Fmoc-csoportot (szerves szekunder aminok; piperidin, morfolin, DEA, valamint TBAF, DBU)

terc-Butil-észter (OtBu): Bevitel: nem lehet sav katalízissel előállítani, mert hasad savra Vastag falú lombikban, zárt térben, óránként rázogatni. Végén fölös izobutilént a lombik kinyitásával elpárologtatni. Z hasítás katalitikus hidrogénezéssel. Szabad N-terminálissal is eláll, mert a tBu nem aktív észter. Hasítás: sok elektronküldő csoport miatt híg savakra; TFA, HBr/jégecet, HCl/hangyasav (lassabban, mint a Boc). Bázisnak ellenáll (40% KOH !, terc-butil-éter nem).

OLDALLÁNC VÉDŐCSOPORTOK Szintézis oldatban: nem szükséges az oldalláncok védelme kivétel: COOH, NH2, (SH) Szilárdfázisú szintézisek: acilezőszer feleslege miatt kell! OH funkciós csoport: Tyr > Ser > Thr (reaktivitási sorrend) Acil védelem (Thr, Ser): lúgos hasítás dehidratálás racemizáció O---N acilvándorlás Éter védelem: Me, Et nehezen hasítható, ezért nem jó. Bzl, tBu alkalmas Benzil-éter (Bzl): Bevitel: kialakítása nagyon nehéz, rossz kitermelés (totál szintézis) Hasítás: H2/kat. (Pd/C), erős savak; HF, TFMSA, TMSOTf, TMSBr, HBr/jégecet

terc-Butil-éter (tBu): Bevitel: X-Aaa-OY + izobutilén + kat. cc. H2SO4 X és Y olyan védőcsoportok, amelyek más módon is hasíthatók, mint savas hidrolízis (Z, Fmoc, Bpoc, Nps, Alloc, ONBzl, OMe, OEt, OFm, OAll) Hasítás: enyhe savakkal; TFA, HCl/jégecet, HBr/jégecet Ser és Thr esetén e két védőcsoport elégséges és megfelelő. Szabad OH acileződése (oldat fázis) megakadályozható pentaklór-fenol (PcpOH) vagy pentafluor-fenol (PfpOH) jelenlétével (aktív észteres kapcsolás), de HOBt, illetve imidazol (His) jelenléte/közelsége elősegíti. Acilezett OH elbontása: NH3/metanol.

Tirozin: külön probléma Bzl: nem elég stabil savakra (50% TFA/DCM 1-2% hasadás) intramolekuláris átrendeződés, mert gyökfogókkal (anizol, krezolok, tioanizol, DTT, etil-metil-szulfid) sem gátolható. Elektronszívó szubsztituensek segítenek: 2,6-diklór-benzil (2,6-Cl2Bzl) vagy p-bróm-benzil (p-BrBzl) csoportok hasításkor stabilabb karbokation jön létre, ezért scavangerekkel jobban befoghatók (de nem teljesen, kb. 5% melléktermék, míg a Bzl esetén általában > 20%) Bevitel: X-Aaa-OH + (Hlg)BzlBr + bázis

2-Bróm-benzil-oxi-karbonil (2-BrZ): Hasítás: erős savakkal

SH-védőcsoportok (Cys): p-Metoxi-benzil (Mob): 4-Metil-benzil (Meb): Hasítás: erős savakra hasadnak (HF), de a Meb hasadása TFMSA szobahőn nem tökéletes és 0°C-on minimális, hasonlóan a TMSOTf hasító reagenshez. A Mob azonban TFA-ban nem elég stabil, tehát utána már ne túl sok kapcsolás. Acetamido-metil (Acm): Bevitel: Cys HCl sója N-hidroxi-metil-acetamid (HOCH2NHCOCH3) +TFA Hasítás: Hg(II)-sók, Tl(tfa)3 , I2, Ag-triflát stabil savakra és piperidinre.

3-Nitro-2-piridin-szulfenil (Npys): Hasítás: tiolokkal, bázisra (pH < 6), HOBt ?, piperidin, low-high HF. Stabil savakra; HF, TFA. Diszulfidhíd kialakítására alkalmas! Tritil (Trt): Bevitel: Cys HCl só + Trt-OH Hasítás: HOAc, TFA, Hg(II)-sók, I2 stabil piperidinre (Fmoc-szintézis) 9-Fluorenil-metil (Fm): Hasítás: piperidin, stabil szervetlen bázis, savak S-terc-butil (StBu): Bevitel: tBu-SCN Hasítás: tiolok, foszfinok stabil: savakra, piperidin

Histidin (imidazol oldallánc) Szabad imidazol acileződhet és/vagy enantioizomerizáció játszódhat le rajta. Acileződés meggátolható átmeneti védelemmel is oldatfázisban (pl. Boc-His(Boc)-OH), de fragmens kondenzáció és SPPS esetén végig védeni kell. Az enantioizomerizáció elkerülésére a p N-t kell védeni, de a legtöbb védőcsoport a t N-t védi. Benzil (Bzl): Na/NH3 redukcióra hasítható (már nem használják). Dinitrofenil (Dnp): Bevitel: 1-fluor-2,4-dinitrobenzol + bázis + X-His-OH Hasítás: tiolok, tiofenol (DMF, DIEA), hidrazinra is (Dde!) Az utolsó aminovédőcsoport hasítása előtt hasítani, mert alkilez (1. Dnp, 2. Boc, 3. többi védőcsoport + gyanta) Ez talán a legbiztonságosabb védőcsoport. Dinitrofenol eltávolítása gélszűréssel. Stabil: savakra, bázisokra.

Tozil (Tos): Bevitel: Tos-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: erős savak (HF, TFMSA, TMSOTf), Ac2O-piridin, részben hasad HOBt-re (DCC/HOBt !) TFA-ban sem elég stabil, ugyanakkor erős savas hasítása sem 100%-os. Benzil-oxi-metil (Bom): Bevitel: Bzl-O-CH2-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: erős savakra (HF, TFMSA, TMSOTf) terc-Butil-oxi-metil (Bum): Bevitel: tBu-O-CH2-Cl + bázis + X-His-OH Hasítás: híg savakra (TFA)

Probléma mindkettőnél: formaldehid keletkezik (azonnal eltávolítani, mert számos mellékreakciót okoz). Különös gond az N-terminális cisztein: Tritil (Trt): Bevitel: TrtOH + Ac2O/H+ Hasítás: TFA (Fmoc-eljárás) , talán a legjobb erre, bár t védelem. terc-Butil-oxi-karbonil (Boc): Kevésbé hatékony, mint a Trt. Allil-oxi-metil: Bevitel: Boc-His(Boc)-OMe + CH2=CH-CH2-O-CH2Cl Hasítás: Pd(0)/PPh3

Triptofán (indol oldallánc) Formil (For): Bevitel: hangyasav + ecetsav anhidrid + védett Trp Hasítás: piperidin , low-high HF, TFMSA(TMSOTf)- tioanizol/TFA Ciklohexil-oxi-karbonil (Hoc): O-C- O Bevitel: Hoc-Cl + X-Trp-OH Hasítás: HF

Peptidkötés kialakítása - aminocsoport aktiválás - karboxilcsoport aktiválás (egyszerűbb, kíméletesebb) Stepwise (lépésenkénti) szintézis: Ha a Z védőcsoport uretán típusú vagy Tos, Pht nincs racemizáció veszély a lépésenkénti kapcsolások esetén.

Fragmenskondenzáció: Fragmenskondenzáció mindig racemizáció veszéllyel jár! Kiküszöbölés, csökkentés: - Gly, Pro (Ala) C-terminálisú fragmensek alkalmazása - azidos kapcsolás - racemizációt csökkentő adalékok (CuCl2, HOBt) fragmensek felépítése lépésenkénti szintézissel

Kapcsolási eljárások Azidos kapcsolás (Curtius 1902): * 98% hidrazin hidrát metanolos oldata, 2 nap alatt kiválik az alkoholos oldatból. X-Aaa-COCl + NaN3 X-Aaa-CON3 + NaCl , ha X=Pht, Tfa

Alkalmazás: lépésenkénti szintéziseknél nagyon ritkán (His) , Az eljárás lassú acilezést és ezáltal sok mellékreakciót eredményez. De oxazolonon át nincs racemizáció (Nd-Nd+Nd-), csak direkt protonelvonással (aminoterminális semlegesítése, bázis felesleg ne!): 1-dietil-amino-2-propanol<DIEA<NMM<TEA (a racemizáció szempontjából) aminosav típusa reakciósebesség racemizáció Z-Pro-Leu-N3 +NH2-Pro-OMe (0%), Z-Pro-Val-N3 +NH2-Pro-OMe (3%), Alkalmazás: lépésenkénti szintéziseknél nagyon ritkán (His) , fragmenskondenzációnál néha. Védett hidrazidok: védőcsoportként működik a szintézis alatt Boc-Aaa1-Aaa2-NH-NH-Z, Z-Aaa1-Aaa2-NH-NH-Boc (ellentétes, szelektíven hasítható védôcsoportok alkalmazása)

1. Curtius-féle átrendeződés: Mellékreakciók: 1. Curtius-féle átrendeződés: 2. Amid képződés: 3. Arg guanidino-csoport: Arg(NO2) Arg(NH2), Arg(X) Orn, Arg(Tos) Arg

4. Diacil-hidrazin képződés: 5. HNO2: Trp, Tyr NO2 szubsztitúció Met, Cys(SAlk) szulfoxid savlabilis védőcsoportok (Boc, Trt) hasadása (< -25°C) Megoldás: RCOOH + (Ph)2P = N3 (difenil-foszforil-azid)

Savkloridos kapcsolás: E. Fischer (oktapeptid), Fodor G. (nonapeptid) 1. 2. Igen reaktív racemizáció (oxazolon), diketopiperazin. Főleg addig alkalmazták, amig csak az azidos kapcsolás volt a versenytárs. Újabban Carpino: Fmoc-Aaa-Cl(F) alkalmazását javasolja (SPPS).

Elôállítás: Acil-Aaa-OH + PCl5, POCl3, SOCl2 (magas hőmérséklet) Problémák: foszfor szennyezés a peptidekben Tos és Pht védelem esetén ez nem történik.

Vegyes anhidrides kapcsolás: - d+1 » d+2 - gyors, jó termelés, egyszerű feldolgozás - racemizáció ( TEA» NMM » N-metil-piperidin) Vegyes anhidrid képzés: THF, dioxán oldat, - 15°C, 2-4 15 perc izolálás nélkül használni

Hőmérséklet! 0°C-on diszproporció történik láncletörés, hiányos szekvenciák alakulhatnak ki ennek következtében. Kapcsolás: - 15°C - 5°C-ra melegítés közben kb. fél óra, majd RT CO2 eltávolításra, (NMM.HCl kiválik). Feldolgozás: egyszerű extrakcióval.

Más típusú vegyes anhidridek: 1. Difenil-foszfinsav: Aminosavak hatása a vegyes anhidrides kapcsolásra: 1. X-Arg(Y)-OH laktám gyűrű kialakulás, X-Arg(Y)2-OH ! 2. Asn imid 3. X-Aaa1 + Pro-Aaa3-... fordított acilezés beépítés aktív észteres eljárással vagy X-Aaa1-Pro dipeptidként 4. Boc-His-OH + 2ekv. savklorid egy az imidazol védelmére 5. Val, Ile, Thr (nagy oldallánc b-elágazás) fordított acilezés. Más típusú vegyes anhidridek: 1. Difenil-foszfinsav: számos egyéb foszforsavszármazékkal készítettek vegyes anhidridet. Kén- és arzénsavszármazékok kuriózumok.

2. EEDQ (1-etoxi-karbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin) ClCOOEt TEA EtOH (nem kell savmegkötő ágens → nincs racemizáció) izobutanol származék is használatos REMA (repetitive excess mixed anhydride) módszer. 1-2 AA/nap 1,5 mol savkomponens; 1,5 mol NMM; 1,4 mol izobutil-oxi-karbonil-klorid → -15°C, 1 perc →1 mol aminokomponens (THF v. DMF); -15°C, 2 óra → KHCO3, a védett peptid kicsapódik

Szimmetrikus anhidrides kapcsolás 2 ekv. Z-NH-Ala-COOH + -N=C=N- DCC -NH-C=N- O Z-NH-Ala-CO -NH-C-NH- + DCU Használatakor nincs fordítottan acilezett származék. Hatékony, gyors acilezés. 1 mol aminosav származék elveszik a reakcióban. Nem célszerű drága aminosav származék esetén használni.

-OOC-NH-CHR-CO-NH-CHR'-COO- N-karboxi-anhidridek (Leuchs-anhidridek) NH-CHR-CO CO O + H2N-CHR'-COO- -OOC-NH-CHR-CO-NH-CHR'-COO- OH- pH=10-10,5 0-2oC lúgos pH-n stabil karbaminát Savanyítás: CO2 (~2 perc reakcióidő után) Lúgosítás következő AA-NCA Thr, Ser, Lys, His, Cys oldallánc védelem az acilező komponensben Lys, Cys az aminokomponensben is. Előny: nincs racemizáció, nem kell N-védőcsoportot hasítani. Hátrány: 4-5 aminosav beépítésére, gyenge kitermelés, nincs köztes tisztítás autoacilezés. Alkalmazás inkább poli-a-aminosavak előállítására. Előállítása: Aaa + foszgén (COCl2), Cl3C-O-CO-O-CCl3 (bisz-triklórmetil-karbonát)

Karbodiimides kapcsolások 1 ekv. Z-NH-Ala-COOH + -N=C=N- DCC -NH-C=N- O Z-NH-Ala-CO -NH-C-NH- + DCU NH2-Gly-OMe Z-Ala-Gly-OMe -NH-C-N- O-N acilvándorlás DIC: diizopropil- (jobb oldékonyság) Vízoldékony karbodiimidek: C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid Asn, Gln dehidratálás! CONH2 CN oldalláncban

.. Aktív észteres kapcsolások d+ R-CO-OR' H2N-Q d+ jelleg növelése elektronszívó csoport Szubsztituált fenilészterek: (NO2, Cl, F) ONp < OTcp < OPcp < ONSu < OPfp p-nitro-fenilészter (Bodánszki) 2,3,5-triklór-fenilészter pentaklófenilészter (Kovács) pentafluor fenilészter (Kisfaludy) N-hidroxi-szukcinimid észter (vízoldékony) Aminosav >> Peptid (OPcp) O N-O-CO-R O Előállítás: Z-Aaa-OH + fenolszármazék + DCC

"Backing off" aktív észteres kapcsolás Peptid aktív észtere alkalmazása fragmenskondenzációban (jelentős racemizáció) Boc-Val-OH + PcpOH + DCC Boc-Val-OPcp + DCU HCl/EtOAc HCl·H-Val-OPcp Z-Aaa-OH DCC Z-Aaa-Val-OPcp + DCU Z-Aaa-Val-OH PcpOH + DCC Z-Aaa-Val-OMe racemizáció