„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem” Bizonyítékok típusai: indirekt (pl. fotó) direkt (pl. haj) „hideg nyom” (textil) „forró nyom” (DNS)

A gyakorlat: 0. mintagyűjtés a helyszínen DNS extrakció DNS amplifikáció (PCR) DNS festés és elválasztás (gélelektroforézis) Minták összevetése

Személyazonosság DNS-ujjlenyomat alapján Törvényszéki esetek – gyanúsított és bizonyíték egyezés bizonyítása Apasági teszt – (mater semper certa est pater nunquam) Tömegkatasztrófa esetek– Történelmi sírok azonosítása Eltűnt személyek azonosítása Katonai DNS-dögcédula Elkövetők DNS adatbázisának létrehozása Ugyanazok az STR markerek (short tandem repeat) használhatóak

Forensic Sciences Igazságügyi Pszichiátria Igazságügyi Pathológia Igazságügyi Toxikológia Igazságügyi Kriminalisztika Igazságügyi Rovartan Igazságügyi Fogászat Igazságügyi Epidemiológia stb.

Igazságügyi Rovartan: A Magyarországon előforduló légyfajok fejlődésének üteme holttesten: (Schranz Dénes nyomán)  lárva növekedési ideje Házilégy petéje kikel: 10-12 óra múlva Kék dongólégy 12-16 óra múlva Smaragd légy Húslégy petéje azonnal mozog (vivipara) Sajtlégy 2. nap 2mm 3-4mm 1mm 3. nap 2-3mm 5-6mm 4. nap 4-5mm 7-8mm 7-9mm 5. nap 6-7mm 10-12mm 6. nap 13-14mm Báboz 7. nap 8mm 8-9mm 15-16mm Báb (3-4mm) 8. nap Báb (9-10mm) 16-18mm 9. nap Báb (5-6mm) Báb (6-7mm) 19-20mm 10. nap 12. nap (10-12mm) Kirepül (4-5mm) 14. nap (7-8mm) (12-13mm) (7-9mm) 16. nap Báb, majd a 18. napon kirepül (16-18mm) http://hullajelensegek.blogspot.hu/

A DNS ujjlenyomatvizsgálat elméleti alapjai Minden egyes ember egyedi genommal rendelkezik (kivéve az egypetéjű ikreket!). A genomunkat a szüleinktől örököljük. Genetikai variációk sorozatát használhatjuk a különbözőség statisztikai valószínűségének megállapítására A DNS minta információ tartalmát hatékonyan és reprodukálhatóan kell kinyerni (a bíróság több év után is kérhet új vizsgálatot) A jelenlegi DNS-ujjlenyomat standardok nem géneket vesznek figyelembe, a fenotípus tulajdonságairól (rassz, betegségek, hajszín, stb) kevés/semmilyen információt nem kapnak. De a 3. generációs szekvenálással a jövőben minden ismert lesz?

A DNS, mint bizonyíték Mit lehet bizonyítani? Csak az USA-ban 313 esetben engedtek szabadon olyan embereket, akikről a DNS profil vizsgálat bevezetése után derült ki, hogy ártatlanul ítélték el őket http://www.innocenceproject.org/

Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története Sir Alec Jeffreys 1900-as évek: Landsteiner felfedezi az AB0 vércsoportokat, a szerológia tudománya forradalmasítja a törvényszéki vizsgálatokat. Az elkülönítési próba ereje: kb. 103 1980-as évek: RFLP + Southern blot: Alec Jeffreys kidolgozza az első genetikai marker alapú elkülönítést betegségekre. 6 Southern próbával az elkülönítés ereje: 106-108, személyazonosításra is alkalmazzák. 1984: A Colin-Pitchfork ügy Angliában: először alkalmaz a bíróság DNS alapú bizonyítékot két meggyilkolt diáklány esetében. 5000 Narborough környéki férfi önkéntes véradása útján megtalálják a gyilkost. Hátrányok: nagy mennyiségű (50-100 ng) tiszta, nagy molekulasúlyú DNS kell hozzá, nem ideális a gyakran degradálódott mintákhoz The forensic use of DNA started with the work of Alec Jeffreys, a geneticist at the University of Leicester in Britain's Midlands. In 1984, Jeffreys invented the techniques that took human identification from the laboratory to the courtroom. With his co-workers, he also demonstrated that forensic samples, dried stains several years old, contained sufficient DNA to yield conclusive results. Jeffreys proved that even small fragments of DNA molecules were virtually unique to individuals. With appropriate dramatic flair, he called the process he invented "DNA fingerprinting," a term most forensic scientists dislike because it is confusing and can be misleading. Finding the Pitchfork in the Haystack A detective in the East Midlands read of the case and sought Jeffreys' help in solving the vicious murder and rape of two British schoolgirls. The police held a prime suspect in the case, a kitchen porter at an insane asylum who had confessed to one of the murders. They brought Jeffreys semen samples from the murder scenes and a blood sample from the suspect. Jeffreys confirmed that the same person committed both crimes but it was not the suspect the police held. On November 21, 1986, the kitchen porter became the first person in the world to have his innocence proven by DNA testing. Both the police and villagers in the area felt strongly that the killer was someone in their midst. Police were prompted to try something entirely new. All male residents between the ages of 17 and 34 were asked to voluntarily submit a blood sample. Within a month, a thousand men had been "blooded." By May 1987 the number had risen to more than 3,600. Summer turned to Fall, it seemed that this experiment was destined to be as unproductive as the previous, more conventional efforts. Then the police received an unexpected tip. A bakery manager chatting in a pub with some of her employees learned that one of their colleagues, Colin Pitchfork, had convinced another baker to be blooded in his stead. After four long years and the disappointment of the porter's false confession, the detectives felt this was the break they were looking for. They went to Pitchfork's home and moments after arresting him, he confessed. He became the 4,583rd and last man to be tested in the hunt for the Midlands killer. His sample provided a perfect match to the sperm taken from his two young victims. It was September of 1987 and forensic DNA was on its way.

Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története 1984: Karry Mullis kidolgozza a PCR technikát Sokkal kevesebb (1-2ng), rossz minőségű minta is elég hozzá A próba ereje egy szekvencia esetén 102-106 ,ami kevés az elkülönítéshez 1986: PCR + STR: nem kódoló, 4-7 ismétlődésekből álló, egyénenként változó kromoszóma szakasz vizsgálata. Nagyon kevés DNS-t igényel (<1ng), az elkülönítési próba ereje 1014-1023 A Föld lakossága 109 nagyságrendű! 1987 az FBI és NIH támogatásával létrehozzák a Combined DNA Index System (CoDIS) adatbázist. Ebbe helyszínelési minták és elkövetők anyagai egyaránt bekerülnek. Jelenleg kb. 9M adatot tartalmaz. 1990-es évek: a DNS vizsgálat megkérdőjelezhetetlen igazságügyi bizonyítéknak van feltüntetve. „Olyan esetekben, ahol 1:33 Mrd az esélye annak, hogy nem a tettes DNS-ét találták meg nincs is szükség bíróságokra!” - Robert Brower főügyész

az O.J. Simpson ügy Az évszázad pere: “Dollárok vs. DNS” On June 12, 1994, O.J.’s ex girlfriend Nicole Brown and her new friend Ronald Goldman were found dead outside Brown's condominium Az évszázad pere: “Dollárok vs. DNS” vagy „California vs. OJ Simpson”  1995: OJ Simpson-t az esküdtszék Felmentette!

RFLP Multi-Locus Próbák ABO Multiplex PCR STRs mtDNS PCR: Technika sebessége próba ereje (genetikai elkülönítés) alacsony magas lassú gyors Igazságügyi eljárásban használt genetikai markerek összehasonlítása RFLP Multi-Locus Próbák ABO vércsoport Multiplex PCR STRs mtDNS PCR: Figure 1.1 Comparison of DNA typing technologies. Forensic DNA markers are arbitrarily plotted in relationship to four quadrants defined by the power of discrimination for the genetic system used and the speed at which the analysis for that marker may be performed. Note that this diagram does not reflect the usefulness of these markers in terms of forensic cases. Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Igazságügyi DNS vizsgálat markerei ma: STR: 2-7 bp ismétlődő egységekből álló allélok, a centromer környékén, egyénenként változó méretűek. Az FBI 1996-ban létrehozott CODIS adatbázisa ezen alapul. Y-STR: az Y kromoszómaspecifikus STR allélok az apai leszármazást mutatják. A férfi nem megállapításánál (szexuális bűncselekmények) használt lókuszok. Mitokondriális DNS: a sejtmag nélküli sejtekben is van (haj, fog, csont), de csak az anyai leszármazás egyezésére/kizárására alkalmas. A történelmi sírok ill tömegsírok vizsgálatánál alkalmas lehet a degradált nukleáris DNS vizsgálat helyettesítésére. (Romanov család, vietnámi sírok) Mini-STR: degradált minták esetén a sejtmagi STR-ek alternatív lehetősége: egészen kicsi DNS fragmentek amplifikációjával. (2001 szept.11. maradványok esetén pl. ezt használták.) SNPs: egyetlen bázis amplifikációjával és populációs gyakoriságának összehasonlításával http://www.forensicdnacenter.com

Minisatellite Marker (D1S80) GAGGACCACCAGGAAG Repeat régió Határoló (flanking) régiók 16 bp repeat egység STR Marker (TH01) TCAT Repeat régió 4 bp repeat egység Határoló (flanking) régiók Figure 5.1 Schematic of minisatellite and microsatellite (STR) DNA markers. PCR primers are designed to target invariant flanking sequence regions. The number of tandem repeat units in the repeat regions varies among individuals making them useful markers for human identification. Figure 5.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

(A) Hossz polimorfizmus: VNTR és STR – Technika: VNTR-PCR Polimorfizmusok a homológ kromoszómákon és technikai vizsgálatuk (A) Hossz polimorfizmus: VNTR és STR – Technika: VNTR-PCR ---------(AATG)(AATG)(AATG)---------- 3 repeats ---------(AATG)(AATG)---------- 2 repeats (B) Szekvencia polimorfizmus: SNP – Technika: ASA Figure 2.5 Two forms of variation in DNA: (A) sequence polymorphisms and (B) length polymorphisms. The short tandem repeat DNA markers discussed in this book are length polymorphisms. --------AGACTAGACATT------- --------AGATTAGGCATT------- Figure 2.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Y-STR Csak a férfi Y kromoszóma lókuszai amplifikálhatók vele: ha a PCR hatékonysága nem egyenlő a női és férfi STR-ek esetén, jól használható Problémák: A klasszikus bűncselekmények ~99%-át a férfiak követik el… A védelem „Dzsingisz kán érvelése”: Az apai rokonok mind tartalmazzák a hasonló Y-STR haplotípusokat (pl.10%-a a közép-ázsiaiaknak hordozza feltehetőleg Dzsingisz kán haplotípusát)

Mitokondriális DNS (mtDNS) Control region (D-loop) 1/16,569 cyt b ND5 ND6 ND4 ND4L ND3 COIII ATP6 ATP8 COII 12S rRNA 16S ND1 ND2 COI OH 9-bp deletion OL F V L1 I Q M W A N C Y S1 D K G R H S2 L2 E P T HV1 HV2 16024 16365 73 340 576 “16,569” bp 1 22 tRNAs 2 rRNAs 13 genes Hypervariable Region1 Hypervariable Region2 Heavy (H) strand Mitokondriális DNS (mtDNS) Előnyök: Egyetlen sejt tartalmaz ~1000 mt-ot, 1 sejt szenzitivitás Égett minták esetén, haj, csontmaradványok esetén jó Anyai rokonságot közvetlenül mutatja Mitochondria Light (L) strand Hátrányok: Heteroplasmia – nem homogén mt. populáció a sejtekben Figure 10.1 Schematic showing the circular mitochondrial DNA genome (mtGenome). The heavy (H) strand is represented by the outside line and contains a higher number of C-G residues than the light (L) strand. The 37 RNA and protein coding gene regions are abbreviated around the mtGenome next to the strand from which they are synthesized (see Table 10.2). Most forensic mtDNA analyses presently examine only HV1 and HV2 in the non-coding control region or displacement loop shown at the top of the figure. Due to insertions and deletions that exist around the mtGenome in different individuals, it is not 16,569 bp. Figure 10.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Pontmutációk (bázis szubtitúciók), amelyek gyakorisága 1%-nál nagyobb a populációban 5 Millió található kb. a humán genomban Minden-Semmi válasz kapható ~50 SNPs ugyanakkora erővel jósol jó kizárást, mint a 13 STR lokusz A magáncégek is alkalmazzák populációgenetikai vizsgálatoknál

3ul elegendő a DNS- kivonáshoz Biológiai minták, mint bizonyítékok vér ondó nyál vizelet haj fog csont szövet VÉR: 3ul elegendő a DNS- kivonáshoz

DNS-extrakciós protokollok SZERVES SZŰRŐPAPÍR CHELEX lyukasztás Mosás extrakciós pufferben PCR Reagensek SDS, DTT, EDTA proteinase K INKUBÁLÁS (56 oC) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Vér beszárítása a speciális szűrőpapíron vér VORTEX DNS cc mérés nélkül PCR végrehajtása víz INKUBÁLÁS 5% Chelex INKUBÁLÁS(100 oC) DNS cc. mérés CENTRIFUGÁLÁS Centrifuge Felülúszó ELTÁVOLÍTÁSA Vizes fázis új csőbe DNS KONCENTRÁLÁS (ethanol precipitation) TE puffer Figure 3.1 Schematic of commonly used DNA extraction processes. Mg-ions are removed by Chelex, Dnases are so inactivated, boiling destroy cell membrane. Filter paper is a special cellulose-resin paper, blood can be stored for years in a dry conditions. Organic method is a classical dna extraction protocol Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

elkülönítése spremiumoktól Differenciál DNS extrakció törvényszéki mintából: áldozat epitélsejtjeinek elkülönítése spremiumoktól SDS, EDTA és proteinase K (sejtlízis puffer) mintavétel inkubálás37 oC centrifugálás Elkövető spermiumai és áldozat epitélsejtek összekeveredve spermium pellet Felülúszó eltávolítása SDS, EDTA és proteinase K + DTT Figure 3.2 Schematic of differential extraction process used to separate male sperm cells from female epithelial cells. DTT lizálja a spermium fejeket “Férfi fázis” DTT: Dithiothreitol: spermium fehérjebontása spermium pellet “Női fázis” Figure 3.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Capillary filled with polymer solution Mi a technikai alapja az STR lókuszok vizsgálatának? Laser Inlet Buffer Capillary filled with polymer solution 5-20 kV - + Outlet Sample tray Detection window (cathode) (anode) Data Acquisition Sample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Kapilláris Gélelektroforézis Kapillárisok Elektródák a folyadék injekcióhoz Capillary gel electrophoresis has been demonstrated for the separation and detection of DNA sequencing samples. Enzymatic dideoxy nucleotide chain termination was employed, using fluorescently tagged oligonucleotide primers and laser based on-column detection (limit of detection is 6,000 molecules per peak). Capillary gel separations were shown to be three times faster, with better resolution (2.4 x), and higher separation efficiency (5.4 x) than a conventional automated slab gel DNA sequencing instrument. Agreement of measured values for velocity, resolution and separation efficiency with theory, predicts further improvements will result from increased electric field strengths (higher voltages and shorter capillaries). Advantages of capillary gel electrophoresis for automatic DNA sequencing instruments and for genomic sequencing are discussed. Nucleic Acids Res. 1990 March 25; 18(6): 1415–1419. Fluoreszcensen jelölt primerekkel

CODIS (Combined DNA Index System, developed by FBI and NIH) Kromoszóma szám CODIS was an outgrowth of the Technical Working Group on DNA Analysis Methods (TWGDAM, now SWGDAM) which developed guidelines for standards of practice in the United States and Canadian crime laboratories as they began DNA testing in the late 1980s. TWGDAM was sponsored by the FBI Laboratory which hosted several scientific meetings a year at Quantico, Virginia, to accelerate development of laboratory guidelines and peer-reviewed papers to support forensic DNA testing which was, to some, an unproven forensic tool. TWGDAM completed a white paper in October 1989 which provided conceptual and operational concepts for a Combined DNA Index System to share DNA profiles among crime laboratories similarly to automated fingerprint identification which had become commonplace in law enforcement during the 1980s. The FBI Laboratory began a pilot project with six state and local crime laboratories to develop software to support each laboratory's DNA testing and allow sharing of DNA profiles with other crime laboratories. The DNA Identification Act of 1994 formally authorized the FBI to operate CODIS and set national standards for forensic DNA testing. The TWGDAM guidelines served as interim standards until recommendations were provided by a DNA Advisory Board required under the Act. Although the Act was passed in 1994, CODIS did not become fully operational until 1998 CODIS identifies 13 markers, plus Amelogenin (AMEL) to determine sex:[2] CSF1PO D3S1358 D5s818 D7s820 D8S1179 D13s317 D16s539 D18s51 D21s11 FGA THO1 TPOX vWA Nem-specifikus marker

FBI’s core STR Lókuszok: 13

Kibővített STR lókuszok az FBI, InterPol, stb. használatában

LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard D3S1358 (8 alleles) VWA (14 alleles) D16S539 (9 alleles) D2S1338 Blue panel Green panel Yellow panel Orange panel D21S11 (24 alleles) D8S1179 (12 alleles) D18S51 (23 alleles) TH01 (10 alleles) FGA low (19 alleles) FGA high 250 bp* 139bp 200 bp 160 bp 300 bp 340 bp 350 bp 150 bp LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard 100 bp Red panel D19S433 (15 alleles) D5S818 TPOX D13S317 D7S820 CSF1PO AMEL (2 alleles) Figure 5.6 AmpFlSTR® Identifiler allelic ladders (Applied Biosystems). A total of 205 alleles are included in this set of allelic ladders used for genotyping a multiplex PCR reaction involving 15 STR loci and the amelogenin sex-typing test. Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Hogyan értelmezzük a CODIS file STR kromatogrammokat? GeneScan: STR lókusz neve Genotyper: Allél (repeatek száma): az azonos körülmények között Futtatott referencia mintával hasonlítva pontosan megadja a repeatek számát Peak magasság: relativ fluorescencia unit (RFU)

Helyszíni STR Profil összevetése 2 gyanúsítottéval 3 lókusz alapján Exklúzió: Nincs találat Gyanúsított 2 Inklúzió: Van találat Bizonyíték

A jövő/jelen igazságügyi tudománya? Egy Genome-Wide Association vizsgálat 5 lókuszt azonosított (PRDM16, PAX3, TP63, C5orf50, és COL17A1) amelyek az arc morfológiáját egyértelműen befolyásolják, mások a szem-és hajszín kialakításában részt vevő allélok- at vizsgáltak Pl. a Pax3 alléljai a nasion hosszát határozzák meg Citation: Liu F, van der Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, et al. (2012) A Genome-Wide Association Study Identifies Five Loci Influencing Facial Morphology in Europeans. PLoS Genet 8(9): e1002932.