Eredmények Vizsgálataink során először az izolált törzseket identifikáltuk molekuláris genetikai eszközökkel (1. táb.). A törzsekkel végzett AFB1 bontási vizsgálat eredményei alapján (1. graf.) a szennyezett területekről izolált 20 törzs jelentős része képes az aflatoxin B1 bontására. A leghatékonyabban (90%) a Pseudomonas citronellolis ZS1, Pseudomonas pseudoalcaligenes FEH 28, Pseudomonas putida DN1, Pseudomonas stutzeri Kö5 és a Pseudomonas azelaica TN5 törzsek képesek az AFB1 degradációjára. Az SOS-Chromoteszt vizsgálat eredményei viszont azt mutatják, hogy nem mindegyik törzs képes az AFB1 genotoxikus hatását megszüntetni. Eredményeink szerint csupán két törzs a Streptomyces albus K15 és a Pseudomonas putida DN1 képes az AFB1 eredményes degradációra, úgy hogy a keletkező bomlástermék nem rendelkezik genotoxikus hatással. A két törzs közül a K15 közel 75%, míg a DN1 90%-os AFB1-biodegradációs képességgel rendelkezik. Következtetés: A toxikus tulajdonságokat hordozó szerves szennyező anyagok mikrobiológiai bontása során minden esetben meg kell győződni a a káros biológiai hatás megszűnéséről is. Jóllehet az aflatoxin metabolizmusra képes mikroba törzseknél az eredeti toxin szint drasztikus csökkenés nagy hatékonyságot jelez, azonban sok esetben olyan metabolitok is keletkeznek, melyek a toxin eredeti biológiai hatását elérik, vagy meghaladhatják. Az analitikai és ELISA alapú toxinszint mérési eredmények tehát minden esetben kiegészítendőek a biológiai hatásmérésen alapuló ökotokiológiai mérésekkel, hogy a biodekontaminációra legalkalmasabb, biztonságos törzsek kerülhessenek kiválasztásra. Köszönetnyilvánítás: A kutatásunkat a MYCOSTOP Tech_08-A3/ OM-00234/2008 pályázat és a KMOP / projekt keretében végezhettük el. Olajszennyezett talajokból izolált mikroorganizmusok Aflatoxin B1 degradációs aktivitásának vizsgálata Cserháti Mátyás 1, Krifaton Csilla 1, Szoboszlay Sándor 1, Háhn Judit 1, Kukolya József 2, Kriszt Balázs 2 1 Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék, Szent István Egyetem, Páter K. U. 1. H-2100 Gödöllő, Hungary; 2 Agruniver Holding Kft., Ganz Á. u. 1., H-2100 Gödöllő, Hungary Bevezetés Az aflatoxin B1 (továbbiakban AFB1) egy karcinogén mikotoxin, melyet az Aspergillus flavus és az A. parasiticus gombák termelnek metabolitként. A citotoxikus hatása mellett az AFB1 az egyik legerősebb természetes eredetű mutagén szennyező. Ezen tulajdonságok következtében nem meglepő, hogy a legalacsonyabb határértéket – 0,2 µg/kg (EFSA, 2006) - rendelték hozzá, mely előfordulhat az élelmiszerekben és takarmányokban a nemzetközi hatóságok a mikotoxinok között. A teljes éves gazdasági veszteség a világon, csak az aflatoxinoknak köszönhetően, több milliárd Euró. Laboratóriumunkban az elmúlt évek során hazai olajszennyezett területekről származó talaj és talajvízmintákból, speciális szelekciós eljárással szénhidrogénbontó mikroorganizmusokat izoláltunk. Ennek eredményeként egy közel 300 tételből álló mikroorganizmus törzsgyűjteményt alakítottunk ki, melynek tagjai különböző szénhidrogének biodegradációjára képesek. Mivel az aromás szénhidrogének szerkezete jelentős hasonlóságot mutat az aflatoxinok szerkezetével, megvizsgáltuk a fenti gyűjteményből származó, 20 aromás-bontó törzsnek az AFB1 biodegradációs képességét. Anyag és módszer Törzsek identifikálása: Az általunk izolált törzseket 16S rDNS szekvencia analízis alapján azonosítottuk. AFB1 biodegradáció vizsgálata: A kísérleti rendszereket 300 ml-es Erlenmeyer lombikokban állítottuk be, melyben 45 ml LB tápoldathoz 5 ml 0,6 OD sűrűségű mikroba inokulumot adtunk, majd 4ppm AFB1 toxin koncentrációt állítottunk be. A kísérlet során 3 napon keresztül, 28 o C-on, 170 rpm fordulatszámon inkubáltuk a beálított tenyészeteket. 72 óra elteltével mintáztuk a lombikok tartalmát: a felülúszó és a pellet maradék aflatoxin tartalmát ELISA tesztrendszerben vizsgáltatuk meg. AflatoxinB1 ELISA teszt: A méréseket a Soft Flow Biotechnology Kft. (Gödöllő) végezte az általuk kifejlesztett TOXI-WATCH nevű ELISA kittel. Az ELISA méréseket 3 párhuzamos mintából háromszori ismétlésben végezték. Törzs jelölésekBaktérium fajok identifikálási eredményeIzolálás ŐR 16Cupriavidus basilensisTermészetvédelmi terület BRB 6ACupriavidus basilensisTermészetvédelmi terület ŐR 10Serratia liquefaciensTermészetvédelmi terület K2Streptomyces heliomycini. Olajjal szennyezett talaj K14Streptomyces cavourensis Olajjal szennyezett talaj K15Streptomyces albus Olajjal szennyezett talaj UA58Chryseobacterium formosense Klórozott szénhidrogénekkel szennyezett talaj TN4Chryseobacterium hydrocarbonovorans Olajipari szennyvízből izolált ZS1Pseudomonas citronellolis Komposztból izolált FEH28Pseudomonas pseudoalcaligenes Komposztból izolált TN5Pseudomonas azelaica Olajipari szennyvízből izolált ZV6Pseudomonas monteilii v. Pseudomonas putida Olajipari szennyvízből izolált DN1Pseudomonas putida Olajipari szennyvízből izolált KÖ5Pseudomonas stutzeri Komposztból izolált NZS9Microbacterium esteraromaticum Komposztból izolált EL1Microbacterium barkeri Komposztból izolált CSZ4Paracoccus sp. Komposztból izolált NZS6Pseudoxanthomonas suwonensis Komposztból izolált H4Pseudoxanthomonas kalamensis Komposztból izolált J4Arthrobacter protophormiae Komposztból izolált 1. ábra: az Aflatoxin B1 szerkezete 1. táblázat: Az izolált törzsek identifikálása és származása 1. grafikon: Az AFB1 bontási kísérlet ELISA és SOS-Chromoteszt eredményei SOS-Chromoteszt vizsgálatok ismertetése: Az SOS-Chromomteszt Kit-et (Environmental Bio-Detection Products Inc. Kanada) a gyártó által kiadott használati útmutató alapján hajtottuk végre. Az enzim aktivitást (β-galaktozidáz és alkalikus foszfatáz relatív koncentrációját) ELx800 (BioTek Instruments, Inc.) készülékkel 405 és 620 nm hullámhossztartományon mértük. A minták genotoxicitása IF = 1,5 (Legault et al, 1996), e-fölött a minták genotoxikusak, alatta biztonságosak.