5. A T-sejtek ontogenezise II. A szelekciós folyamatok...

Sir Macfarlane BURNET: “klónszelekciós elmélet” A timociták szelekciója Sir Macfarlane BURNET: “klónszelekciós elmélet” Nobel Lecture December 12, 1960.: „Immunological Recognition of Self” ☺ az antigénnel való találkozást megelőzően kialakul egy nagy, diverz, redundáns antigén-specifikus receptor készlet (populáció) elsődleges nyirokszervekben: klón-deletio/anergia (populáció szelekció) saját struktúrák iránti tolerancia ☺ másodlagos nyirokszervekben: szelektív klonális expanzió (antigén inger, differenciált sejtaktiváció) fajlagos immunválasz Újabb kiegészítés: A receptor készlet kialakulása a központi nyirokszervekben (“antigén-független”), de az Ag-el való találkozás után (perifériás nyirokszervek) is módosulhat pl. antigén-függő receptor revízió, újraszerkesztés (?)

A T sejt szelekció „két oldala” a „tanító oldal”: MHC,peptid és APC tulajdonságai és mennyiségi viszonylatai a „tanítvány oldal”: az érésben levő T sejtek reakciója a „tanításra” ... és az érem harmadik oldala: a tímusz-függő és tímusz-független külső szabályozás

A timociták érésének szelekciós fázisa 1. Feltételek: éretlen DP timociták megjelenése ( T 1/2 : ~ 3 nap, ~ 80%) MHC-I és MHC-II molekulákat expresszáló APC-el való találkozás/kapcsolat (cTEC, mTEC, DC, Mf sejtek) - a specifikus felismeréshez: megfelelően széles αβ TcR repertoár a szelekcióhoz és a további differenciálódáshoz szükséges TcR szignál rendszer és koreceptorok (CD4,CD8) Pozitív: a saját MHC struktúrák felismerésére alkalmas sejtek szelekciója 2. Típus/cél : + - Negatív: saját MHC-saját peptid (auto)- reaktív T sejtek eliminációja Időtartam: hosszú (egérben: ~ 14 nap)

3. Funkcionális következmény/ jelentőség : -a saját MHC-felismerésre nem képes/ funkcióképtelen, redundáns T-sejt állomány kiküszöbölése - az immunológiai memória kialakulása + szelekció - a tímuszban és a periférián is (!) a hozzá-férhető saját peptideket felismerő T-sejtek aviditás-érzékeny apoptotikus eliminálódása (nem teljes) - Centrális (p) tolerancia - szelekció

T sejtek fejlődése a tímuszban Véletlenszerű differenciálódás CD4+ vagy CD8+ Vagy: CD4hi, CD8lo Lck,GATA3 CD4+ ThPoK: CD8 CD8hi, CD4lo Runx3 CD8+, CD4 Centrális tolerancia!

Szelekciós környezet/kölcsönhatások: Stróma steroid sex hormon (ösztrogen, tesztoszteron) IL-7,IL-6, TSLP, ... Notch ligand (Jagged, Delta-1,...) ? IM DP timocita CD8 CD4 TcR CD3 DC MHC-I MHC-II c/mTEC MHC-I MHC-II ? neuropeptidek, szimpatikus és paraszimpatikus beidegződés/ szignálok Glukokortikoidok (stróma/stressz) Purinerg szignálok (sejtpusztulás, lokális)

☺ ☺  Az IL-7 citokin szignál és a timocita érés α IL-7 IL-7 IL-7 Stróma sejt α IL-7 IL-7 IL-7 IL-7R ---------------------------------------------------------------------- γc membrán ---------------------------------------------------------------------- JAK-3 ? PI-3K STAT-5 STAT-5 P sejtmag ☺ target gén γc jel-függő Bcl-2 indukció részleges anti-apoptotikus szignál  IL-7 -/- timocitákban : Bcl-2 ☺ Az IL-7 szignál szükséges a TcRγ gén hozzáférhetőségének/ aktivációjának indukálásához

A strómális eredetű citokinek jelentősége erősen csökkent timocita szám (különösen TN1-TN2) αβ T-sejtek csökkent száma, γδ T-sejtek teljes hiánya, ami TcRγ-trg egérben részlegesen helyreáll • IL-7-/- • IL-7-/- ,γC -/- van egy részleges TCRγ-gén átrendeződés ! (?) Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP): IL-7-hez hasonló szignálok az IL-7Rα-t (és nem a γC-t) használja receptorként IL-7/TSLP jel hiányában a TcRγ lókusz hozzáférhetetlen és inaktív: Nincs RAG1,2-indukált hasítás a Jγ1 génben

A pre-T sejt stádium CD3,Lck/Fyn, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76 A NOTCH szignál egy fontos kiegészítő szignál a pre-T sejtek túléséhez, a rekombináció befejeződéséhez ! CD3,Lck/Fyn, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76 Beta-lánc átrendeződés (allél kizárás); RAG1,2 alfa-lánc átrendeződés: late pre-T, több α lánc is lehet! DP (CD4+ CD8+) proliferáció, túlélés (IL-7 citokin + Notch is !)

A pre-TcR jelátvitel: a lipid raftok és a Notch-szignál esszenciális szerepe ezen stádium túlélésében TcRβ/pre TCRα TcR αβ, CD4+CD8+ timocita γδ T sejt pre T sejt palmitoiláció raft “túlélési”, differenc. szignál Ligand ? + NOTCH

sorrend: γδ-TcR, αβ-TcR A TN1- TN4 - ISP – DP érési folyamat során: a TN2-TN4 fázisban lezajlik a TcR-lánc gének (γ,δ,β,α) átrendeződése (szomatikus rekombinációja) szabályozás: - RAG 1, 2 génexpresszió: feltétel - IL-7, IL-7Rα expresszió és jelátvitel valamint NOTCH szignál kritikus - bHLH TRF-ok (E2A, HEB, Id): kritikus sorrend: γδ-TcR, αβ-TcR

A szelekció előtti utolsó lépések... Tímusz TN3/pre-T TN4 ISP DP CD25 - CD44 - TcRαβ, CD3(L), CD8(L) CD25 - CD44 - TcRαβ, CD3 CD4,CD8 CD25 + CD44 - TcRβ, pTcRα CD3 CD25 - CD44 - TcRβ, pTcRα CD3 pTα/TcRβ–szignál/Notch1 (Lck/Fyn, CD3, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76) TCF1/LEF1 (HEB) transzkripciós faktorok RAG 1,2 IL-7 TCF1, LEF1, SOX4 transzkripciós faktorok CD3, ζ 13

Ezt követi a nagy, diverz DP T-sejt populáció „fájdalmas” szelekciója apoptózis (~ 90-95%) 14

A T sejt szelekció főbb jellemzői tulajdonság pozitív szelekció negatív szelekció helyszín érintett stróma sejtek szelekciós mechanizmus immunológiai konzekvencia kérgi állomány epitél sejtek (cTEC) a saját MHC-t felismerő T sejtek túlélése saját MHC-korlátozás kifejlődése medulla csontvelői eredetű makrofág és DC, mTEC a saját MHC+saját peptid kombinációkra nagy aviditással reagáló T sejt klónok deletioja (centrális) tolerancia kialakulása

A timocita szelekció lefolyása: (példa: MHCA egér) • Csontvelő (BM) T sejt prekurzorok tímusz TcR TcR repertoár (random generált) specificitás: idegen Ag + MHCB specificitás: idegen Ag + MHCA Nincs funkcionáló receptor specificitás: saját Ag + MHCA pozitív szelekció nincs pozitív szelekció (MHCB miatt): apoptózis pozitív szelekció hiánya: apoptózis deletio: negatív szelekció (nagy affinitású saját peptid felismerés) Diff., CD4+,CD8+ SP, periféria

Az MHC (allél) és a peptid szerepe a timocita szelekcióban TcR gén klónozás MHC: H-2Db H-Y specifikus, H-2Db korlátozott T sejt α β peptid: H-Y • • • nőstény, H-2Db nőstény, H-2Dk hím, H-2Db fejlődő T sejtek transzgén TcR+ -------------------------------------------------------------------------------------- Timusz APC MHC-típus H-Y antigén H-2Db H-2Db H-2Dk van nincs nincs SZELEKCIÓ ------------------------------------------------------------------------------ pozitív van van nincs negatív van nincs nincs funkcionális T sejt : CD8+, transzgén TcR+ nincs nincs van (H-Y specifikus) Hím specifikus hisztokompatibilitási ag 17

Mi is az a „funkcionális aviditás? ► Az affinitás értelmezése molekuláris szinten: kon pl. MHC-I + Ag peptid (p) koff (MHC-p) Affinitás: ~ asszociációs egyensúlyi állandó, Ka (M-1) ► Hogyan detektálható a molekuláris affinitás? Ez főleg a gyógyszerfejlesztés területén (receptor-ligand/gátlószer kölcsönhatások) jelentős, de a limfocita ontogenezis szelekciós lépéseinek vizsgálataiban is igen fontos!

A funkcionális aviditás (FA): Az affinitások molekula-pár expresszió (mennyiség) szerinti súlyozott integrációja (összesége) egy sejt-pár kapcsolata esetén (pl. APC-timocita): FA: m x Ka1 + n x Ka2 + p x Ka3 + r x Ka4… ► A timocita- APC kölcsönhatás során az 1,2,3,4... indexek az egyes, szelekcióban kritikus sejtfelszíni molekuláris kölcsönhatásokra utalnak. Pl. TCR-MHC(p); B7-CD28 kostimuláció, LFA-1-ICAM-1 integrin kcsh.; DC-Sign-ICAM-3 szignál, stb... Ezek együttesen egy „kummulatív jelerősséget” határoznak meg, mely meghatározó a szelekciós lépés kimetelében

A funkcionális aviditás meghatározó tényezői T-cell synapse

A kvantitatív modellt alátámasztó tények: Kísérleti modell: különböző MHC háttér alapján tenyésztett TcR-transzgén egerek Ovalbumin-specifikus TcR transzgén egerekből származó T sejtekkel: In vitro affinitás mérések (SPR): a pozitívan szelektáló ligandok TcR-affinitása << (103x), mint a klonális deléciót kiváltó peptidek affinitása.  erős agonista peptid alacsony koncentrációban: pozitív szelekció  ugyanazon peptid magas koncentrációban: klonális deléció (NS) In vivo class II MHC modellek : ugyanazon peptid alacsony és magas koncentrációja pozitív vagy negatív szelekciót egyaránt indukálhat, amit FTOC vizsgálatok is megerősítettek

Receptor szelekció (újraszerkesztés) fejlődő T-sejtekben szekunder rekombináció: “használhatatlan TcR-ok lecserélése”  receptor-editing: “veszélyes TcR-ok átszerkesztése” (antigén- és klón-függő) használhatatlan, vagy túl alacsonyan expresszált receptorok eliminációja/ cseréje RAG+ nincs TcR nincs ligand RAG - alap szignál: közepes aviditás az érett T-sejt repertoár számára pozitívan szelektált sejtek RAG+ Ag-indukált szignálhiány: magas affinitás az autoreaktív T-sejt receptorok re-editálása internalizált TCR

A T-sejt receptor keresztreaktivitás és következményei: Egy adott T-sejt nem 1, hanem kb. 103 egymástól kissé különböző szerkezetű peptidet képes kötni és az eltérő peptidekre kvantitatívan különböző válaszokat ad!  egy T-sejt alacsony peptid-denzitásra csak akkor válaszol, ha a TcR-affinitás magas  ha a TcR-affinitás alacsony, akkor csak magas ligand-denzitásra válaszol Egy adott Ag-peptid képes „megosztani” a T-sejt készletet: alacsony, ill. magas ligand-denzitás esetén válaszoló T-sejtekre ! Az antigén-prezentáló környezet (APC-k) szerepe nagyon fontos a szelekció “finom-hangolásában” !

Túlélés-Anergia egyensúly: A Notch- és IL-7-szignálok elősegítik a fejlődő T-sejtek túlélését 1. Az IL-7 szignálok emelik az anti-apoptotikus Bcl2 fehérjék szintjét 2.) a Notch-Receptor hasadási terméke a Notch-IC pl. negatívan szabályozza az apoptotikus jelátvitelt apoptózis negatív szabályozása

Centrális – (perifériális) tolerancia és az autoreaktivitás tímusz PS/NS révén szelektált SP T-sejt állomány CD4+ medulla CENTRÁLIS TOLERANCIA (nem tökéletes !) CD8+ autoreaktív T-sejt periféria PERIFÉRIÁS TOLERANCIA: anergia apoptózis szignálok effektor T-sejt fenotípus diverzió regulációs T-sejtek DC/Mf szerepe… effektor/ memória Tc és Th